1、ICS 65.020.99 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1103.3一2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分:硫代葡萄糖苦的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived products Part 3: assay of anti-nutrients glycosinolate 061018000m9 2006-07 -10发布2006-1。一01实施中华人民共和国农业部发布.L- -.L. 刚自本标准附录A为资料性附录，附录B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本
2、标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。NY /T 1103.3-2006 本标准起草单位:中国农业科学院油料作物研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人:李培武、杨月欣、丁小霞、韩军花、张文、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。I NY/T 1103.3一2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第3部分:硫代葡萄糖苦的测定1 范围本标准规定了转基因油菜籽及其产品中硫代葡萄糖昔的高效液相色谱测定方法。本标准适用于转基因油菜籽及其产品中硫代葡萄糖昔的高效液相色谱测定。2 规范性引用文件下列文件
3、中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 5491粮食、油料检验抨样、分样法GB/T 14488. 1 油料种籽含油量测定法GB/T 14489. 1 油料水分及挥发物含量测定法3 术语和定义3. 1 3.2 3.3 下列术语和定义适用于本标准。转基因油菜籽genetically modified rap臼时指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的油菜籽。转基因油菜籽
4、产品pr叫uctsderived from genetically modified rapes创指转基因油菜籽的直接加工产品和含有转基因油菜籽的产品。相对校正系数m归nsefactors 待测硫代葡萄糖昔的摩尔吸光系数与内标的摩尔吸光系数的相对比值。4 原理用70%甲醇水榕液提取硫代葡萄糖昔，然后在阴离子交换树脂上纯化，并酶解脱去硫酸根，反相色谱柱分离，紫外检测器检测硫代葡萄糖背。5 试验材料转基因油菜籽及其产品、受体油菜籽及其产品。如果对转基因油菜籽产品中的硫代葡萄糖昔进行测定，转基因油菜籽产品和受体油菜籽产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。6试剂除非另有说明，仅
5、使用分析纯试剂;水为蒸榴水。6.1 硫酸醋酶溶液:Helix 如matiaH1型(EC3. 1. 6. 1) ，每毫升硫酸醋酶溶液的活性单位不低于0.5，NY /T 1103.3-2006 硫酸醋酶榕液应即配即用。6.2 葡聚糖凝胶悬浮液:称取10g DEAE Sephadex A 25葡聚糖凝胶，浸泡在过量的2mollL醋酸溶液中，静置沉淀，再加入2mollL醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的2倍，于4C冰箱中存放，待用。6.3 70%甲醇溶液:取70mL甲醇，加水定容至100mL。6 . 4 0 . 02 mollL醋酸铀溶液:称取0.272g醋酸饷(CH3刀Na.3HzO)，加人800m
6、L水溶解，用醋酸调节溶液的pH至4.0，加水定容至1L。6.5 6 mollL甲酸咪瞠榕液:称取204g咪哇，溶解于113mL甲酸中，待溶液冷却后加水定容至500mL。6.6 内标:用丙烯基硫代葡萄糖昔(Mr=415.49)作内标，当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖昔时，用苯甲基硫代葡萄糖昔(Mr=447.52)作内标。对硫代葡萄糖昔含量低于20.0mollg的样品，可将下述6.6.1至6.6.4中的内标溶液浓度降为1mmollL至3mmollL。内标溶液在4C的冰箱中可存放3周，在一18C条件下可保存更长时间，内标溶液的纯度检定参见附录A。6.6.1 5 mmollL丙烯基硫代葡萄糖昔溶液:称取2
7、07.7mg丙烯基硫代葡萄糖昔榕解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.2 20 mmollL丙烯基硫代葡萄糖昔溶液:称取831.0mg丙烯基硫代葡萄糖昔榕解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.3 5 mmollL苯甲基硫代葡萄糖昔溶液:称取223.7mg苯甲基硫代葡萄糖昔溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.6.4 20 mmollL苯甲基硫代葡萄糖昔榕液:称取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖昔溶解于80mL水中，加水定容至100mL。6.7 流动相A:超声波脱气30s的水。6.8 流动相B:取200mL色谱级乙脯，加入800mL水，混匀，超声波脱气30So 7 仪器
8、和设备7.1 通常实验室仪器设备。7.2 研钵或微型研磨机。7.3 聚丙烯离子交换微柱:底部筛板为100目。7.4 离心机:带有10mL转头，并能获得5000g的相对离心力。7.5 0.45m水溶性微孔滤膜。7.6 色谱柱:填料颗粒小于或等于10阳的反相句或Q柱，例如:Novapak Ct8柱，5阳(150mmX3.9 mm) ; Lichrosorb Rp18柱，5m(150 mm x 4.6 mm) ; Spherisorb Ct8柱，10阳(150mm X 4 mm) ; Lichro spher Rp8柱，5m(125mmX4 mm)。7.7 高效液相色谱仪:具备梯度洗脱，柱温可控制在
9、30C，带紫外检测器。8 试样的制备按照GB5491的规定对试验材料进行缩分，将缩分后的试验材料分成3等份。第一份按GB/T14489.1的规定测定水分及挥发物含量，第二份按GB/T14488. 1的规定测定含油量，第三份为硫代葡萄糖昔待测试样。如果试验材料的水分及挥发物含量超过10%，应在45C条件下通风干燥，并将干燥后的待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成9.1和9.2。2 NY /T 1103.3-2006 9 操作步骤9.1 称样分别称取200.0mg待测试样至A、B两支离心管中。9.2 硫代葡萄糖营的提取9.2.1 将离心管75C水浴1min，加入2mL70%沸甲
10、醇溶液后，立即加人200L5 mmol/L内标溶液至A管中，200L20 mmol/L内标溶液至B管中。9.2.2 75C水浴10min，其间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，5000g离心3min，分别转移上清液至10mL刻度试管AB中。9.2.3分别向A、B管中再加入2mL 70%沸甲醇溶液，75c水洛约30s，旋涡混匀后，75C水浴10min，其间每隔2min取出离心管旋涡混合，然后取出离心管冷却至室温，5000g离心3min，分别转移上清液至原刻度试管AB中。9.2.4 用水调节AB管中的提取液至5mL，混匀。此提取液在一18c暗处可保存2周。9.
11、3 离子交换微柱的制备每一个试样提取液准备一支聚丙烯离子交换微柱，垂直置于试管架上。取0.5mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液至每一离子交换微柱中，注意不要使悬浮液粘附在柱壁。静置待液体排干后，取2mL6mol/L甲酸咪唾溶液冲洗树脂，排干后，再用1mL水冲洗树脂两次，每次均让水排干。9.4 纯化、脱硝酸根9.4.1 取1mL提取液缓缓加人已制备好的离子交换微柱中，注意不能搅动树脂表面，待液体排干后，分别加人1mL 0.02 mol/L醋酸铀溶液两次，每次加人后均让液体排干。9.4.2 加人100L硫酸醋酶溶液至离子交换微柱，35c条件下反应16h。9.4.3 分别用1mL水冲洗离子交换微柱2次，
12、洗脱液收集于试管中。9.4.4 用水将洗脱液定容至5mL，充分混匀后，用0.45m的微孔滤膜过滤，待进样。洗脱液在一18C暗处可存放1周。9.5 空白试验用相同的样品进行相同的前处理，但不加内标物质，以检定样品中内标物质是否存在。9.6 色谱条件9.6.1 仪器条件:流动相流速为1.0mL/min，柱温30C，紫外检测器检测波长229nm。9.6.2 洗脱梯度9.6.2.1 对SpherisorbC18柱，10m(150mmX 4 mm)和NovapakCt8柱，5m(150mmx3.9mm)，洗脱梯度见表1。表1Spherisorb C18柱和NovapakC18柱洗脱梯度时间流动相A(%)
13、流动相B(%) Omin 15 85 lO min 100 。12min 100 。15 min 15 85 20min 15 85 9.6.2.2 对LichrosorbRP18柱，5m(150mmX4.6 mm)，洗脱梯度见表2。3 NY/T 1103.3一2006表2Lichrosorb RP18柱洗脱梯度时间流动相A(%)Omin 100 1 min 100 20min 。25min 100 30min 100 9.6.2.3 对LichrospherRP8柱，5m(125mmx4 mm)，洗脱梯度见表30表3Lichr，嗣pherRP8柱洗脱梯度时间流动相A(%)Omin 100 2
14、.5 min 100 20min 。25min 。27min 100 32min 100 9.7 色谱测定进样量10L，记录峰面积。10 结果表示10.1 单组分硫代葡萄糖曹含量的计算流动相B(%)。100 。流动相B(%)。100 100 。10. 1. 1 以每克干基脱脂油菜籽中所含硫代葡萄糖昔的微摩尔数表示，按式(1)计算:-_二一一A.g n TT 1 D1Tfkg可.(1) 式中:D1一一干基脱脂油菜籽中硫代葡萄糖昔含量，单位为微摩尔每克(mollg); Ag一一脱硫硫代葡萄糖昔峰面积;As一呐标峰面积;Kg一一脱硫硫代葡萄糖昔相对校正系数，按附录B的规定;m一试样质量，单位为克(g
15、);n一-试样中加入内标的量，单位为微摩尔(mol);w一一试样中水分、挥发物和含油量之和，以质量百分数表示(%)。计算结果表示到小数点后两位。10.1.2 以每克脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖昔的微摩尔数表示，按式(2月十算:A.g n TT , , 1 D2=-.-一一XKg-X一一一X(1- Ws) . (2) As m凸1-w式中:Ag、Asn、m、Kg、w同式(1);D2一一脱脂油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖昔的含量，单位为微摩尔每克(mol/g); 4 NY /T 1103.3-2006 Ws一一标准水分及挥发物含量，以质量百分数表示，数值为8.5%或9%。计算
16、结果表示到小数点后两位。10.1.3 以每克干基油菜籽中所含硫代葡萄糖昔的微摩尔数表示，按式(3)计算:Ag ,. n ,. TT ,. 1 D3 = :0 X _!:_ X K X . . . . . (3) s m.1-wt 式中:Ag,As, n、m、Kg同式(1);D3一一干基油菜籽中硫代葡萄糖昔含量，单位为微摩尔每克(mollg); wt一一试样中水分及挥发物含量，以质量百分数表示(%)。计算结果表示到小数点后两位。10. 1 .4 以每克油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡萄糖昔的微摩尔数表示，按式(4)计算:Ag ,. n ,. TT ,. 1 D4=二一XKgX一一一X(1-
17、Ws) . (4) As m.1-wt 式中:Ag、As、，n、m、Kg、1汉且D4一一油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖昔的含量，单位为微摩尔每克(mollg)。计算结果表示到小数点后两位。10.2 硫代葡萄糖苦含量的计算硫代葡萄糖昔含量等于单组分硫代葡萄糖昔(单组分峰面积应大于峰面积总和的1%)含量的总和，以每克样品中所含硫代葡萄糖昔的微摩尔数表示。如果A、B两管硫代葡萄糖昔含量的测定值满足11中允许差的要求，硫代葡萄糖昔的含量为两测定值的算术平均值。计算结果表示到小数点后两位。11 允许差11 . 1 同一试样、同一方法、同一操作者、同一仪器、同一实验室短期内两次测定值允许差:如果硫代
18、葡萄糖昔含量低于20.00mollg，允许差不大于2.00mollg;如果硫代葡萄糖昔含量在20.00mol/g-35.00mollg范围内，允许差不大于4.00mollg;如果硫代葡萄糖昔含量大于35.00mollg，允许差不大于6.00mol/go11.2 同一试样、同一方法、不同操作者、不同仪器、不同实验室两次测定值允许差:如果硫代葡萄糖昔含量低于20.00mollg，允许差不大于4.00mollg;如果硫代葡萄糖昔含量在20.00mol/g- 35 .00 mollg范围内，允许差不大于8.00mollg;如果硫代葡萄糖昔含量大于35.00mollg，允许差不大于12.00mollg。
19、5 NY /T 1103.3-2006 附录A资料性附录)内标纯度的检定A.1 检定方法内标纯度的检定方法主要包括:一一用本标准规定的方法进行高效液相色谱分析。-一用高效液相色谱的离子对技术分析完整的内标(不脱硫酸根的内标)。一一用气相色谱分析脱硫酸盐和硅烧化的内标。-一用芥子酶(EC3.2.3.2)水解内标，根据水解产物葡萄糖的浓度检定内标的纯度。A.2 结果分析如果用色谱方法检定内标纯度，当色谱图中主峰面积不小于总峰面积的98%时，表明内标纯度符合本标准要求。如果用酶水解方法检定内标纯度，当水解产物葡萄糖的摩尔浓度不小于内标摩尔浓度的98%时，表明内标纯度符合本标准要求。6 序号1 2 3
20、 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 附录B规范性附录)相对校正系数表B.l脱硫硫代葡萄糖苦的相对校正系数硫代葡萄糖背名称中文英文2-短基-3-丁烯基脱硫硫代葡萄糖背Desulfopitrin 反式2-资基-3-丁烯基脱硫硫代葡萄糖背Des吐fc把pi-prc狸。，itrin丙烯基脱硫硫代葡萄糖昔Des叫fosinigrin4-甲亚枫丁基脱硫硫代葡萄糖背Desulfogluraphanin 2-瓷基-4-戊烯基脱硫硫代葡萄糖背Desulfc思lunapoleiferin5-甲亚枫戊基脱硫硫代葡萄糖背Desulfoglucoalyssin 3-丁烯基脱硫硫代葡萄糖背Des
21、ulfoglunapin 4-短基-3-P51味甲基脱硫硫代葡萄糖背Desulf，4-hydroxyglubrassicin 4-戊烯基脱硫硫代葡萄糖背Des吐fc略lubrassinapm苯甲基(辛基)脱硫硫代葡萄糖背Desulfoglu址。阳.eolin3-P51味甲基脱硫硫代葡萄糖背口ulfoglubrassicin苯乙基脱硫硫代葡萄糖背Desulfc也lunast町tiin4-甲氧基3-呵|垛甲基脱硫硫代葡萄糖背Desulf，4-methoxyglubrassicin 1-甲氧基?鸣|喋甲基脱硫硫代葡萄糖背Desulfa口区沼lu，brassicin其他Other d臼吐foglulS
22、inolatesNY /T 1103.3-2006 相对校正系数(Kg)1.09 1. 09 1.00 1.07 1.00 1.07 1. 11 0.28 1. 15 0.95 0.29 0.95 0.25 0.20 1. 00 一二一7 OONl的.的OFFH问Z中华人民共和国农业行业标准转基因植物及其产晶食用安全检测抗营养素第3部分:硫代葡萄糖苦的测定NY/T 1103.3-2006 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9号* * 印张0.75字数7千字2006年9月北京第1次印刷印数:1-1000册定价:10.00元并* * 开本880mmx 1230mm 1116 2006年9月第1版书号:16109 837 版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894 NYl
