1、ICS 65.020.99 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1103.2一2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:膜蛋白酶抑制剂的测定Safety assessment of genetically modified plant and derived produc也Part 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter 061018000028 2006-07 -10发布2006 -10-01实施中华人民共和国农业部发布NY /T 1103.2-2006 前本标准由中华人民共和国农业部提出。本
2、标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人:杨月欣、王竹、韩军花、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。I NY /T 1103. 2-2006 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:膜蛋白酶抑制剂的测定1 范围本标准规定了转基因植物及其产品中膜蛋白酶抑制剂的测定方法。本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中膜蛋白酶抑制剂的测定。其他的转基因植物，如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。2 术语和定义2.1 2.2 下列术语和定义适用
3、于本标准。转基因植物genetically modified p)ant 指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。转基因植物产晶products derived from genetically modified plant 指转基因植物的直接加工产品和含有转基因植物的产品。3 原理膜蛋白酶可作用于苯甲酷-DL-精氨酸对硝基苯胶(BAPA)，释放出黄色的对硝基苯胶，该物质在410nm下有最大吸收值。转基因植物及其产品中的膜蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使吸光度值下降，其下降程度与膜蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在410nm处测定吸光度值的变化，可对膜蛋白酶抑制剂
4、活性进行定量分析。4 试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。如果对转基因植物产品中的膜蛋白酶抑制剂进行测定，转基因植物产品和受体植物产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。5 试荆除非另有说明，仅使用分析纯试剂;水为蒸馆水。5.1 三瓷甲基氨基甲烧tris(hydroxymethyl)aminomethane，TrisJ。5.2 0.05 mollL Tris缓冲液:称取6.05g Tris和2.94g氯化钙(CaC122H20)溶于800mL水中，用浓盐酸调节溶液的pH至8.2，加水定容至1L。5.3 0.01 mollL氢氧化锅溶液:称取0.4g氢氧化铀，加入
5、800mL水溶解后，再加水定容至1L。5.4 戍烧:己烧(1:1, V:V)。5.5 1 mmollL盐酸。5.6 膜蛋白酶:大于10000 BAEE fJ./mg。BAEE为Na-苯甲酷七精氨酸乙烧醋(Na-benwyl-L吨inineethyl ester) 0 BAEE u(BAEE单位)表NY/T 1103.2-2006 示膜蛋白酶与BAEE在25t、pH7.6、体积3.2mL条件下反应，在253nm波长下每分钟引起吸光度值升高0.001，即为1个BAEEUo 5.7膜蛋白酶溶液:称取10mg膜蛋白酶，溶于200mL 1 mmollL盐酸中。5.8 苯甲耽心L-精氨酸对硝基苯胶(ben
6、zoyl-DL吨ininep-nitroanilide, BAPA)。5.9 BAPA底物榕液:称取40mg BAPA，榕于1mL二甲基亚枫中，用预热至37t的Tris缓冲液稀释至100mLo BAPA底物潜液应于实验当日配制。5.10 反应终止液:取30mL冰乙酸，加水定容至100mL。6 仪器和设备6.1 通常实验室仪器设备。6.2 恒温水浴箱。6.3 分光光度计。6.4 旋涡搅拌器。6.5 电磁搅拌器。7 操作步骤7.1 试样的制备将试验材料磨碎，过筛(筛盘为100目200目)。称取0.2g1g试样，加入50mL 0.01 mollL氢氧化铀溶液，pH应控制在8.410.0之间，低档速电
7、磁搅拌下浸提3h，过滤。漫出液用于测定，必要时，可进行稀释。如果试样的脂肪含量较高(如全脂大豆粗粉或豆粉)，应在室温条件下先用戍烧:己烧(1:1)脱脂。脱脂方法如下:将试样浸泡于20mL戍皖:己烧(1:1)中，低档速电磁搅拌30min，过滤。残渣用约50mL戍皖:己烧(1:1)淋洗两次，收集残渣。然后进行浸提。7.2 测定智和对照管的制备取两组平行的试管，按表1在每组试管中依次加人试样浸出液、水和膜蛋白酶溶液，于37t水洛中1昆合后，再加入5.0mL预热至37C的BAPA底物溶液，从第一管加人起计时，于37t水浴中摇动混匀，并准确反应10min，最后加人1.0mL反应终止液。用0.45m微孔滤
8、膜过滤，弃初始滤液，收集滤液。表1测定管反应体系单位为毫升试剂非抑管测定管1测定管2测定管3测定管4试样浸出液0.0 0.3 0.6 1. 0 1.5 水2.0 1. 7 1. 4 1. 0 0.5 膜蛋白酶溶液2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 BAPA底物溶液5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 反应终止液1. 0 1. 0 1.0 1. 0 1.0 在制备测定管的同时，应制备试剂对照管和试样对照管，即取2mL水或试样浸出液，然后按顺序加入2mL膜蛋白酶溶液、1mL反应终止液和5mLBAPA底物溶液，混匀后过滤。7.3 测定以试剂对照管调节吸光度值为0，在410nm波长下测定各测定管
9、和对照管的吸光度值，以平行试管的算术平均值表示。8 结果表示8. 1 酶活性的表示方法NY /T 1103.2-2006 8. 1 . 1 膜蛋白酶活性单位(TU):在规定实验条件下，每10mL反应混合液在410nrn波长下每分钟升高0.01吸光度值即为一个TU。8.1.2 膜蛋白酶抑制率:在规定实验条件下，与非抑管相比，测定管吸光度值降低的比率。8.1.3 膜蛋白酶抑制剂单位(TIU):在规定实验条件下，与非抑管相比，每10mL反应混合液在410m波长下每分钟降低0.01吸光度值即为一个TIU。8.2 计算8.2.1 各测定管的膜蛋白酶抑制率按式(1)计算。ArI- AT- ATIl TIR
10、=川Al川x100% . (1) 式中:TIR一一膜蛋白酶抑制率，%;AN一一非抑管吸光度值;AT一一测定管吸光度值;A四一一试样对照管吸光度值。r1N 8.2.2 只有膜蛋白酶抑制率在20%-70%范围内时，测定管吸光度值可用于膜蛋白酶抑制剂活性计算，各测定管膜蛋白酶抑制剂活性按式(2)计算。ArI-A中ATIlTI=川、，二川.(2) 式中:TI一一膜蛋白酶抑制剂活性，单位为膜蛋白酶抑制剂单位(TIU); t一一反应时间，单位为分钟(min)。8.2.3 单位体积试样浸出液中膜蛋白酶抑制剂活性以测定用试样浸出液体积(单位为mL)为横坐标，TI为纵坐标作图，拟和直线回归方程，计算斜率，斜率值
11、即是单位体积试样浸出液中膜蛋白酶抑制剂活性(单位为TIU/mL)。当测定用试样浸出液体积和TI不是一条直线关系时，单位体积试样浸出液中膜蛋白酶拥制剂活性用各测定管单位体积膜蛋白酶抑制剂活性的算术平均值表示。8.2.4 试样中膜蛋白酶抑制剂活性按式(3)计算。TlVx VX F TI几1=.(3) m 式中:TIM一一试样中膜蛋白抑制剂活性，单位为膜蛋白酶抑制剂单位每克(TIU乍); TIV一一单位体积试样浸出液中膜蛋白酶抑制剂活性，单位为膜蛋白酶抑制剂单位每毫升(TIU/mL); V一一试样浸出液总体积，单位为毫升(mL);F一一稀释倍数;m一一试样质量，单位为克(g)。9 允许差重复条件下，
12、两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的10%。3 CON-N.的OF俨H讪Z中华人民共和国农业行业标准转基因植物及其产晶食用安全检测抗营养素第2部分:腹蛋白酶抑制剂的测定NY/T 1103.2-2006 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100026 网址:) 中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销等* * 等铸祷印张0.5字数5千字2006年9月北京第1次印刷印数:1-1000册定价:8.00元开本880mmx 1230mm 1116 2006年9月第1版书号:16109 836 版权专有侵权必究举报电话:(010) 65005894
