1、华人鉴定入境检翰栓擅行标准SN/T 3729.11-2014 晶及饮料中常见7k第口部分:擂飞撞PC日PLC5!晶科的检测Identification of fruit species in export food and drink一Part 11 : Detection of C.reticulatand C.sinensis ingredient一PCR-DHPLC method 2014-01-13发布2014田08-01实施中华人民共和国发布E家展量监督检验栓接总踌目。昌SN/T 3729(出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法共分为11个部分:第1部分:草莓成分检测PCR法;第2部
2、分:杏成分检测实时荧光PCR法;一一一第3部分:梨成分检测实时荧光PCR法;一一一第4部分:芒果成分检测实时荧光PCR法;一一第5部分:木瓜成分检测实时荧光PCR法;一一一第6部分:苹果成分检测实时荧光PCR法;一一第7部分:葡萄成分检测PCR法;第8部分:山植成分检测实时荧光PCR法;第9部分:桃成分检测实时荧光PCR法;一一一第10部分:香蕉成分检测实时荧光PCR法;一一第11部分:楠、橙成分检测PCR-DHPLC法。本部分为SN/T3729的第11部分。本部分是按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 3729.11-2014 本
3、部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本部分主要起草人:陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、王斌、曹际娟、邓婷婷、陈文柄。I 1 范围出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第门部分:福、橙成分检测PCR皿DHPLCi去SN/T 3729.11-2014 SN/T 3729的本部分规定了本部分适用于果汁、果酱及法的最低检出限(LOD)为1%(重PCR检测方法。2 规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 分析实验室用GB/T 27403 实验室质量3 术语、定义和缩略i吾下列术语和定义适用于本文3.1 术语和定
4、义3. 1. 1 榻Citrusreticulata 情是芸香科柑擂属情种，为3.1.2 4萤Citrussinensis 橙是芸香科柑擂属橙种，为常绿乔木双子叶植物。3.1.3 i音?十Clarifiedjuice 经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁。3. 1. 4 i虫?十Cloudyjuice 未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。3.2 缩略语3.2.1 DNA: deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。3.2.2 dNTP: deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核昔酸三磷酸。3.2.3 dATP: deoxyadenosin
5、e triphosphate，脱氧腺昔三磷酸。的定性检测。本部分所规定方SN/T 3729.11-2014 3.2.4 dCTP: deoxycytidine triphosphate，脱氧胞昔三磷酸。3.2.5 dGTP: deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟昔三磷酸。3.2.6 dTTP: deoxythymidine triphosphate，脱氧胸昔三磷酸。3.2.7 dUTP: deoxyuridine triphospha忧，脱氧尿昔三磷酸。3.2.8 CT AB: cetyltrithylammonium bromide，十六皖基三甲基澳化钱。3.2.9
6、 Tris: TrisC Hydroxymethyl) aminomethane，王起甲基氨基甲烧。3.2.10 EDT A: Ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胶四乙酸。3.2.11 Taq: Thermus aquaticus，水生栖热菌。3.2.12 OD: optical density，光度密度。4 方法提要提取DNA，以DNA为模版，分别采用情橙的特异性检测引物进行PCR扩增，将PCR产物经DHPLC分析，进行食品及饮料中桶橙成分的检测鉴定，其中以桶撞果肉DNA为阳性对照，以非桶橙来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。5 试剂和材料除另有规
7、定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1 检测用引物和探针:见表10表1寻|物和探针序列引物/探针引物/探针序列(53) 扩增片段长度靶基因内参照5端引物CTTGA丁TTTACCAAAGATGATGA植物核酬糖1，5-二磷酸竣化酶159 bp /加氧酶基因内参照3端引物TTCTTCGCATGTACCCGCAG 桶u橙5端引物GGAATCTGGATTAGAATGAG 92 bp 橙TrnL-TrnF基因间区情/橙3端引物GCGGAATACTCGAACGGTC 5.2 CTAB提取缓冲液:20g/L CTAB,1.4 mo
8、l/L NaCl , O.l mol/L Tris-丑Cl，0.02mol/L Na2EDTA, pH 8.0。5.3 CTAB沉淀液:5g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。5.4 三氯甲:皖(氯仿)。5.5 异丙醇。5.6 70%乙醇(体积比)。5.7 NaCl溶液C1. 2 mol/L)。5.8 琼脂糖:电泳纯。5.9 澳化乙链。5.10 分子量标准品(100bp2 000 bp)Cbp:base pair，碱基对)。5.11 电泳缓冲液:Tris 54 g，棚酸27.5g , 0.5 mol/L TE缓冲液CpH8.0)20mL，加蒸悟水至1000 mL; 使用时10倍稀释。
9、5.12 澳化乙链贮存液:用水配制成10mg/mL。SN/T 3729.11-2014 5.13 加样缓冲液:0.25%澳酣蓝，质量浓度为40%的蔚糖水溶液。5.14 10XPCR缓冲液:氧化饵100mmol/L，硫酸镀160mmol/L，硫酸镜20mmol/L , Tris-HC1C pH 8.8)200 mmol/L , Triton X-100 1% ,BSA 1 mg/mL。5.15 dNTP搭液(dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP):各2.5mmol/L。5.16 Taq酶(5U/p.L)。5.17 三乙基镀醋酸盐(threeethyl ammonium acetate
10、 , TEAA)。6 仪器设备6.1 DNA热循环仪。6.2 电泳仪。6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4 恒温水浴锅。6.5 离心机:离心力二三12OOOg 0 6.6 微量移液器:0.5L10L，10L100L，20L200L，200Ll000L。6.7 研钵及粉碎装置。6.8 涡旋震荡器。6.9 紫外检测仪。6.10 pH 计。6.11 量筒:感量50mL。6.12 天平:感量0.01g。6.13 真空冷冻干燥机。6.14 DHPLC仪(变性高效液相色谱仪)。7 检测步骤7.1 DNA提取7.1.1 清汁将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干;称取
11、0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加入5mL CTAB裂解液，650C孵育1h，间期不断混匀几次:8 OOOg 离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700L三氯甲:院，剧烈氓匀30s , 14 500g离心10m巾，取650L上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300 p.L CT AB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h;14500g离心20min，弃上清液，加入350L1. 2 mol/L NaCl，MU烈振荡30s，再加入350L三氯甲烧，剧烈混匀30s , 14 500g离心10min;分别取上清液320L，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后
12、，-200C1 h , 14 500g离心20min，弃上清液，加入500L70%乙醇，海匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入30LddH20海解，一20oC贮存备用。7. 1. 2 浊汁将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8OOOg离心10mi口，去上清，加入5mL CTAB裂解液，65oC孵育1h，其余步骤同7.1.1。3 SN/T 3729.11-2014 7. 1. 3 固体样品称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mL CTAB裂解液，65C孵育1h，其余步骤同7.1.1，7.2 DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光
13、度计分别检测260口m和280nm处的吸光值A260和A280，DNA的浓度按照式(1)计算:式中:A一260nm处的吸光值;N 核酸稀释倍数。当AZ60/AZ80比值在1.71.97.3 PCR扩增7.3.1 PCR反应体系50L反应体系:10XPCRDNA聚合酶(5U/L)2 U、模板7.3.2 PCR反应程序变性30s , 60 C退火30s , 72 C 7.3.3 电泳取2g琼脂糖，于100mL 制胶。在电泳槽中加入电泳缓加样缓冲液混合，点样。9V/c 泳结果并记录。7.3.4 DHPLC检:测c =A X N X 50/1 000 . ( 1 ) 引物对(5mol/L)各2L、Ta
14、q体积为50L。程序为:94 C预变性5min, 94 C 。4c保存。链贮存液至终浓度为0.5g/mL, L PCR扩增产物分别和适量凝胶2/3。紫外检测仪下观察电PCR产物5L进行DHPLC检测，洗脱液由缓冲液A(O.lmmol/L的TEAA，含0.25%的乙睛)和缓冲液B(O.lmmol/L的TEAA，含25%的乙睛)组成，以0.9mL/min的流速在50C下自动洗脱。8 结果判定与表述8.1 PCR扩增产物电泳检测结果内参照的PCR产物大小为159bp。8.2 PCR-DHPLC检测结果8.2.1 含情成分产物DHPLC信号峰保留时间与情阳性对照一致。8.2.2 含橙成分产物DHPLC
15、信号峰保留时间与橙阳性对照一致。4 SN/3729.11-2014 8.3 结果表述8.3.1 产物DHPLC信号峰保留时间与桶阳性对照一致判为含情成分，表述为检出桶成分。8.3.2 产物DHPLC信号峰保留时间与情阳性对照不一致判为不含榻成分，表述为未检出搞成分。8.3.3 产物DHPLC信号峰保留时间与橙阳性对照一致判为含橙成分，表述为检出橙成分。8.3 .4 产物DHPLC信号峰保留时间与橙阳性对照不一致判为不含橙成分，表述为未检出橙成分。9 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行。产J ZON|二.由Nh的HZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第门部分:楠、橙成分检测PCR-DHPLC ;:去SN/T 3729.11-2014 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533;.:-网址中囡标准出版社秦皇岛印刷厂印刷令、印张0.75字数9千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/1 6 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元号书号155066 2一27536SN/T 3729. 11一2014
