1、华人民共和出入境检瞌检疫行标准SN/3767.12-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第12部分:玉米下25品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 12! Maize T-25 2014-01-13发布2014-08-01实施民支元b-，.飞9二守圃、也忘、震、队，由外品随后F飞户-;:;-!w3_5.;on饲吁:24酬，3231S川致nVJ中华人员共和自发布国家质量监督
2、检验检疫总局SN/T 3767.12-2014 目USN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法为系列标准，由下列部分组成:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆
3、A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜丑7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第12部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出
4、的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由回家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:曹际娟、徐君怡、郑秋月、李一尘、刘金华、高东微、姜丽、李志勇、石磊、凌莉、唐大运、张璜。I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第12部分:玉米下25品系SN/T 3767.12-2014 SN/T 3767的本部分规定了食品中转基因玉米T-25品系特异性的环介导等温扩
5、增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于玉米及其加工产本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 19495.2 GB/T 19495.3 GB/T 19495.5 GB/T 19495.7 SN/T 3767.2-2014 选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理)检测方法第2部分:筛根据转基因玉米T-25品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物、外引物和环引
6、物各一对，SN/T 3767.12-2014 特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用品t酶启动循环链置换反应，在玉米T-25品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2十结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6. 1. 2 显色班显色原理SYBR Gr巳巳n1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001 000倍。在不发生扩
7、增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC士0.5oC和80.0oC士0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量程0.5LlOL;量程10L100f-lL;量程100f-lL 1 000 FL。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T
8、6682 J:p一级水的规格。6.3.2 dNTPs i容液:每种核音酸法庭10mmoI/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/f-lL。6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HC1CpH值为8.8)、100mmol/L硫酸钱、100mmol/L 氧化专甲、20mmol/L硫酸镇、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸馍溶液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5 mol/Lo 6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因玉米T-25
9、品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2，环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:262 bp 夕卡引物1CF3，5-3):GGAACGACTCAATGACAAGA 外引物2(B3，5 -3): AGAGGCATCTTCAACGATG 内引物l(FIP，5人3): GGAATCCGAGGAGGTTTCCG-ATCTTCGTCAACATGGTGG 内引物2CBIP，5一3): TTGCCCAGCT ATCTGTCACTTT-GCAATGATGGCATTTGT AGG 环引物l(FLP，5-3，):TTGGAGTAGACAAGCGTGTC 环引物2C
10、BLP，5一3):T AGTGGAAAAGGAAGGTGGC 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2 SN/T 3767.12-2014 6.4 .1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4 .1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以
11、进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 玉米T-25品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1I显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心.防止显色液混合进入反应液中。表1玉米T-25品系LAMP反应体系组分工作液浓度力日样量/L反应体系终浓度ThermoPol缓冲液10 2. 5 1 外号|物1(F3) 10mol/L O. 5 O. 2mol/L 外引物2(83)10 /1- mol/L O. 5 0.2
12、/1- mol/L 内引物lFIP)40 flmol/L 1. 0 1.6mol/L 内引物2(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L 环引物l(FLP)20mol/L 1. 0 O. 8mol/L 环引物2BLP)20 /1- mol/L 1. 0 0.8mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L D 严1 mol/L 硫酸续150 mmol/L 1 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L 1 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/1- L 水补足至25.06.4.4 LAMP反应参数63.0 oC
13、 :l: 0.5 oC恒温扩增90min ,80.0 oC :l: 0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。3 SN/T 3767.12-2014 6.5.2 空白对照:反应管中液体呈撞色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照
14、结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少l管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因玉米T-25品系初筛阳性，还应通过下列方法录A): 黯窍荡露荡震荡霸主按照GB/T19495.5进行一一一可对外引物PCR扩增产8 结果表述8.1 8.2 检测结果为转基因玉米T-254 SN/T 3767.12一2014附录A(资料性附录)转基因玉米T-25品系基因序列A.1 转基因玉米T-25品系特异目标序列(来自Accessionno.A Y629235、AX195438和AX695990)GACATGATACTCCTTCCACCGCCGTGCGACAG
15、CGACAATGGCGGAACGACTCAATGACAAG FLP , BLP: 5 寸户ONlNF.hh的H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第12部分:玉米T-25品系SN/T 3767.12-2014 民中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网tll: 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元7飞书号:155066 2-27466 3767.12-2014
