1、华人民共和国出入境检验检疫行标准SN/3767.30-2014 出口食晶中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第30部分;油菜RT-73晶系Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 30: Oilseed rape RT-73 2014-01-13发布2014心8-01实施.:-，飞如飞-113。旷气，、扩型2飞网路，wHcntw31S由用也诏4约82315中华人民共和-国发布国家质量盟主督栓验检接
2、总局SN/T 3767.30-2014 目。检A但由皿检境平、附中川U町1忖东勇3浒广志为民国李时阳州盹法机民Em方盯人:酬本华剌不中5Di M蛐局林制疫和扣。4咽口凶田的口里扩于自检晴温轧妇如境圳等起本出入莉忡则。提出凌规利会林环。的专员吉刊阶.，.，.，.，.1.，分出及委国AJ-MM万加系古刷品叮叮系.，.，部给涉理和韬旦协呵呵叫ruz:rz山r呵呵rtLr叫时注:mmmm刚刚MmmMmmmmMmm阳山川Mmmzmu脏刷荆川米米米米米豆豆豆豆豆稻自稻稻稻稻稻稻麦芽菜TE的认位草出用选米米米米半斤米米玉玉玉玉玉大大大大大水水水水水以水K小甜油WG件家单起川喃地册343441JLLLhA川L
3、hhhhhLLLLA川hLA川扣上S照文国草要盯分分分分分分才注才i为按本由起主i部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部部r部部部部部部部部部分分意分分分nu-qLU4AEUb7OOQdnu1品门，qu4AEunb7OOQdnu123456789111111111122222222223部部注部部部引第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第第本本请本本。本局疫I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第30部分:油菜RT-73品系SN/T 3767.30-2014 SN/T 3767的本部分规定了导等温扩增CLAMP)初筛检测方法。本部分适用于油菜R
4、T-73C本方法的定性检测低限为O.5 2 规范性引用文件下列文件对于本文件件。凡是不注日期的引用文件，GB/T 6682 GB/T 19495.2 GB/T 19495.3 GB/T 19495.5 GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 防污染措撞环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因油菜RT73品系外源基因和油菜边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异性SN/T 3767.30-2014
5、目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独主区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在油菜RT73品系特异目标序列启动互补链合戚，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应榕液中的Mg2寸结合.产生副产物(焦磷酸馍)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果要清楚判断样品是否为转基因产品。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001
6、000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0 oC土0.5oC和80.0oC士O.5 oC 0 6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL 6.2.4 移液器:量程0.5I_ 10 f-lL;量程10L100f-lL;量程100IL 1 000L。6.2.5 计时器。6.3 试荆和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3
7、.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs溶液:每种核昔酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U If-lL o 6.3.4 10 ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl (pH 值为8.8)、100mmol/L硫酸镀、100 mmol/L氧化专甲、20mmol/L硫酸镜、1%TritonX-100o 6.3.5 氯化镇溶液:25mmol/L。6.3.6 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.7 引物:根据转基因油菜RT73品系外源基因和油
8、菜边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2，序列见附录A。外引物扩增片段长度:207 bp 外引物1(F3 , 5 -3) : GGT AA TT ACTCTTTCTTTTTCTCC 外引物2(B3, 5 -3) :GTGGAATGTTCAATACCTTGA 内引物1(FIP , 5 -3) : GGAGG A TG A TCTTCA TGTCCGG-ATATTGACCATCATACTCATTGC 内引物2(BIP，5人3) : GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCC-TGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、陆性对
9、照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。2 SN/T 3767.30-2014 6.4. 1.3 设两个空白对照:提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4 .2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.
10、4 .3 转基因油菜RT73品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将lL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1油菜RT73晶系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 1 外侧上游引物(F3)10mol/L O. 5 0.2 J1 mol/L 外侧下游引物(B3)10mol/L O. 5 0.2ILmol/L 内侧上游引物(FIP)20mol/L 2. 0 1.6mol/L 内侧下游引物CBIP)20
11、mol/L 2. 0 1. 6 J1 mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 氯化续25 mmol/L 5 5 mmol/L Bst DNA聚合酶8 U/L l 0.32 U/L DNA模板100 ng/L 2 8 ng/ J1 L 水补足至25.06.4 .4 LAMP反应参数63.0 oC :!:0.5 oC恒温扩增90min , 80.0 oC士0.5oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后立即观察结果，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LA
12、MP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。3 SN/T 3767.30一20147 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因油菜RT73品系初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 一按照GB/T19495.5进行实时荧光PCR检测;一一可对外引物P
13、CR扩增产物进行序列测定。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，8.2 4 断和表述。SN/3767.30-2014 附录A(资料性附录)转基因油菜RT73品系基因序列A.1 转基因油菜RT73品系特异目标序列(来自Accessionno. AX685147. 1) 161GGTAATTACTCTTTCTTTTT 181 CTCCATA1寸GACCATCA1ACTCA:寸GCIGATCCATGTAG八ITTCCCGGACATGAAGATCA241 TCCTCCTTCCTTTCCTTGCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTCGTATAAGCTTGTGTCAAT 301 TGTTGACAGA
14、GAATCTTGCTGAAGAATACTCAGAAACAGAGTACTTCAAGGTATTGAAC 361 ATTCCAC A.2 号|物碱基序列及构成F3: GGT AA TT ACTCTTTCTTTTTCTCC 83:GTGGAATGTTCAATACCTTGA F1c F2 FIP: GGAGGATGA TCTTCATGTCCGG-AT ATTGACCATCA T ACTCATTGC B1c 82 BIP: GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCC-TGTTTCTGAGT AATTCTTCAGC b 28|0的.huh的H军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第30部分:油菜RT-73品系SN/T 3767.30-2014 兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平旦因街甲2号(100029) 北京市西城区主旦河北街16号(100045) 总编室:(010)68533533网址巾国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷.x. 印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷子F本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元.y, 书号:155066.2-27485 4 -nu qL nu 叮J寸I户。till-吁，nd T1 / M川cd
