1、ICS 67050X 04 圆雪中华人民共和国国家标准GBT 22948-2008蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of trimethoprim residues in royal jellyLCMSMS method2008-12-31发布 2009-050 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局劣士中国国家标准化管理委员会及仲刖 昌本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、张进杰、石玉秋、王占英、庞国芳。GBT
2、 22948-20081范围蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法本标准规定了蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定。本标准的方法检出限为20 pgkg。2规范性引用文件GBT 22948-2008下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部
3、分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 57251：1 994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，IS0 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理蜂王浆中残留的三甲氧苄氨嘧啶用去离子水提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心后，上清液经OasisMCX离子交换柱”或相当的同相萃取柱净化，用氨水一甲醇洗脱并蒸干，残渣用乙腈一01甲酸水溶液溶解。样品溶液供液相色谱一串联质谱仪测
4、定，外标法定量。4试剂和材料41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44三氯乙酸：优级纯。45甲酸：优级纯。46氨水：分析纯。47三氯乙酸溶液：50(质量分数)。20 g三氯乙酸(44)溶于20 mL水中。48 2甲酸溶液：吸取2 mL甲酸(45)用水稀释至100 mL。49 01甲酸溶液：吸取1 mL甲酸(45)用水稀释至1 000 mL。410流动相：乙腈01甲酸溶液(7+13)。411氨水一甲醇溶液(1+19)：5 mL氨水(46)与95 mL甲醇(42)混合均匀。412三甲氧苄氨嘧啶标准物质(cAs：738705)：纯度99。413 01 mgmL标准储备溶
5、液：准确称取适量的标准物质(412)，用甲醇配成01 mgmL的标准储1)Oasis MCX离子交换柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1GBT 22948-2008备溶液，该溶液在4保存。414标准工作溶液：吸取01 mL标准储备溶液(413)，移至10 mL容量瓶中，用甲醇配成10,gmL的标准工作溶液。该标准工作溶液在4保存。415 Oasis MCX柱或相当者：150 mg，6 mL。用前依次用5 mL甲醇和10 mL水活化。保持柱体湿润。416滤膜：02,um。5仪器
6、51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52液体混匀器。53振荡器。54氮气浓缩仪。55分析天平：感量01 mg和001 g。56真空泵：真空度应达到80 kPa。57聚丙烯离心管：50 mL。58移液器：01 mL，1 mL。59玻璃贮液器：50 mL。510浓缩管：10mL。6试样制备与保存61试样的制备对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均匀。分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样的保存将试样于一18冷冻保存。7测定步骤71提取称取2 g试样，精确至001 g。置于50 mL具塞的聚丙烯离心管中，加入20 mL水，于液体混匀器(52)上快速混
7、匀1 rain，再置于振荡器(53)jr振荡提取lO rain，加入50三氯乙酸溶液05 mL，快速摇动05 rain，以3 000 rrain离心5 min，移取上清液至另一离心管中，再向残渣中加入15 mL水，重复上述步骤，合并上清液。72净化将塞有玻璃棉塞的玻璃贮液器(59)连到Oasis MCX柱(415)上，将上清液(71)倒人玻璃贮液器(59)中，使样液以小于3 mLmin的流速通过Oasis MCX柱，待样液完全流出后，分别用5 mL甲酸溶液(48)和5 mL甲醇(42)洗柱，弃去全部流出液。最后用5 mL氨水一甲醇溶液(411)洗脱，收集洗脱液于10 mL浓缩管(510)中。在
8、45水浴中用氮气浓缩仪(54)吹干。准确NA 1o mL流动相(410)溶解残渣，样液过02 pm滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪测定。73基质标准工作溶液的制备称取4份阴性样品各2 g，精确至001 g。置于50 mL具塞的聚丙烯管中，分别加入4 pL、10 pL、20 pL、40 pL、100 pL标准工作溶液(414)，按71和72步骤操作。制备成浓度为20 ngmL、250 ngmL、100 ngmL、200 ngmL、500 ngmL的基质标准工作溶液。74测定条件741液相色谱参考条件a)色谱柱：Atlantis，3 pm，150 mmX 21 ram(内径)或相当者；b)流动相：乙
9、腈一01甲酸溶液(7+13)；c)流速：02 mLmin；d)柱温：35；e)进样量：20 pL。742质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d) 电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0076 MPa；f)气帘气压力：0069 MPa；g)辅助气流速：7 Lrain；h)离子源温度：450；-)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。GBT 22948-2008表1 三甲氧苄氨嘧啶的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压中文名称 英文名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞气能量v 去簇电压V291230
10、291230 35 50三甲氧苄氨嘧啶 291123 40 50291275 35 5075液相色谱一串联质谱测定751定性测定将被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 土25 土30 士50752定量测定用基质标准工作溶液(73)分别进
11、样，以标准峰面积为纵坐标，以标准添加浓度(ngmL)为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧苄氨嘧啶的参考保留时间为239 rain。三甲氧苄氨嘧啶的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B1。76平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。77空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。3GBT 22948-20088结果计算蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定结果按式(1)计算。Xc筹揣式中：x试样中被测组分残留量，单位
12、为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)V一一样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度范围及重复性方程见表3。表3 添加浓度范围及重复性和再限性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性R三甲氧苄氨嘧啶 2
13、0500 19R0 775 9lg0 847 5 lgR=0622 3lgm 0 681 1注：m为两次测定值的乎均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂王浆中三甲氧苄氨嘧啶的添加浓度范围及再现性方程见表3。4附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。星s m值4 0e43Oe42Oe4l 0e40 O图A1 三甲氧苄氨嘧啶标准物质多反应监测(MRM)色谱图GBT 22948-2008IGBT 22948-2008附录B(资料性附录)回收率本方法中三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及其平均回收率试验数据见表B1。表B1 三甲氧苄氨嘧啶添加浓度及平均回收率试验数据化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率“20 101750 981三甲氧苄氨嘧啶】0 o 97 550，0 1043
