1、ICS 67050X 04 园雪中华人民共和国国家标准GBT 22963-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of zearalanol，zearalanone，diethylstilbestrol，hexestrol and dienoestrol residues in fugu。eels and baked eeILCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施丰瞀髁紫瓣訾糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会及111刖 瞢GBT 22963-2008本标准的附录
2、A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：许泓、吴延晖、何佳、张骏、张曼、林安清、庞国芳。I河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22963-20081范围本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇(zearalan01)、玉米赤霉酮(zearalanone)、己烯雌酚(diethylstilbestr01)、己烷雌酚(hexestr01)、双烯雌酚(dienoestroI)残留量液相色谱
3、一串联质谱测定方法。本标准用于河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定。本标准的方法检出限：玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚为10 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(OBT 63791 2004，ISO 5
4、7251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-一2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓冲液加酶解剂分别提取试样中残留的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚，经硅胶柱净化，用液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42叔丁基甲基醚：色谱纯。43甲
5、醇：色谱纯。44乙腈：色谱纯。45乙酸乙酯：色谱纯。46正己烷：色谱纯。47二氯甲烷：色谱纯。48乙酸：优级纯。49乙酸钠(CH。COONa3H：0)。410氢氧化钠：优级纯。】GBT 22963-2008411 3 molL氢氧化钠溶液：称取120 g氢氧化钠(410)溶于1 000 mL去离子水中。412 02molL乙酸盐缓冲液(pH=52)：称取252 g乙酸(48)和1295 g乙酸钠(49)溶解于800 mL水中，用氢氧化钠溶液(411)调节pH值至5201，加水定容至1 000 mL。413溶解液：正己烷一二氯甲烷(3+2)。414淋洗液：乙酸乙酯一正己烷(3+47)。415洗脱
6、液：乙酸乙酯一正己烷(3十2)。416卢-葡糖苷酸酶硫酸酯复合酶：含p葡糖苷酸酶124 400 unitsmL，硫酸酯酶3 610 unitsmL。417激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇(包括a一玉米赤霉醇和p玉米赤霉醇，各50)纯度97；玉米赤霉酮，纯度97；己烯雌酚，纯度99；己烷雌酚，纯度98；双烯雌酚，纯度98。418标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲酵(43)配制成l mgmL标准贮备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4冰箱中。419内标标准物质：a一玉米赤霉烯醇一4氘代，纯度99；己
7、烯雌酚一8氘代，纯度98。420内标标准溶液：准确称取适量a一玉米赤霉烯醇一4氘代和己烯雌酚一8氘代标准物质，用甲醇(43)分别配制成1 mgmL标准贮备溶液。再以甲醇稀释成适用浓度的混合内标工作溶液，保存于4冰箱中。421 基质提取液：空白样品，除不如入标准工作溶液(418)和内标标准工作溶液(420)外，其他同711713处理后得到的溶液，422基质标准工作溶液：将标准工作溶液(418)及内标标准工作溶液(420)混合后在氮吹仪中吹干，以基质提取液(421)溶解，涡旋30 S后即为基质标准工作溶液。423硅胶固相萃取柱：500 mg，3 mL。424滤膜：02,um。5仪器51液相色谱一串
8、联质谱联用仪：配有电喷雾电离源。5。2分析天平：感量01 mg和001 g。53 自动固相萃取仪或固相萃取装置。54高速均质器：转速大于10 000 rmin。55氮气吹干仪。56烘箱：控温精度土1。57涡旋振荡器。58离心机：转速大于3 000 rmin。59 pH计：测量精度03pH单位。510具塞离心管：25 mL，50 mL。511微量注射器：i00”L。6试样的制备与保存61试样的制备取有代表性样品500 g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。62试样保存将试样于一18下保存。27测定步骤GBT 22963-200871 混合基质标准校准溶
9、液的制备711样品称取称取5个阴性样品，每个样品为5 g(精确到01 g)，将上述样品置于50 mL离心管(510)中，分别加入适量混合标准工作溶液(418)，使各被测组分玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烷雌酚、己烯雌酚和双烯雌酚的浓度分别为25 ngmL、50 ngmL、10 ngmL、25 ngmL、50 ngmL。再分别加人适量内标标准工作溶液(420)，使其浓度均为10 ngmL。712提取加入20 mL叔丁基甲基醚(42)，在10 000 rmin均质1 min。3 000 rmin离心5 min，将上清液全部转移至另一50 mL具塞离心管(510)中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发3
10、0 min，加入15 mL乙酸盐缓冲液(412)，高速均质1 min，3 000 rmin离心5 min，将上清液全部转移至另一25 121L具塞试管(510)中，并在氮吹仪上于40水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80 pL p葡糖苷酸酶(416)混匀，于52烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液(411)将溶液pH值调至7，加入10 mL叔丁基甲基醚，充分混合，3 000 rmin离心2 min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮吹仪上于40水浴中吹干。加入1 mL溶解液(413)，涡旋30 S溶解，待净化。713净化固相萃取净化条件；用6 mL正己烷分两次预洗
11、硅胶柱(423)，流速均为4 mLmin。上样，流速为2 mLmin，在样品试管中加入3 mL淋洗液(414)，混合后过柱，流速为2 mLmin，用3 mL淋洗液以3 mLmin的速度淋洗，加入2 mL空气以4 mLmin的速度吹过硅胶柱。用6 mL洗脱液(415)洗脱，流速为2 mLmin，加入2 mL空气以6 mLmin的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮吹仪上于40水浴中吹千，加入1mL流动相，涡旋30 S溶解。溶液过02 pm滤膜后，供液相色谱一串联质谱测定。72实测样品溶液的制备称取待测样品5 g(精确到01 g)于50 mL离心管中，加入内标工作溶液，使其最终定容浓度均为10
12、 ngmL。按712和713操作。73空白基质溶液的制备称取阴性样品5 g(精确到01 g)于50 mL离心管中，按712和713操作。74测定条件741液相色谱参考条件a)色谱柱：ZORBAX Eclipse SB-C8，35 pm，150 mmX46 mm(内径)或相当者；b)柱温：25；c)流动相：乙腈水(7+3)；d)流速：o5 mLmin；e)进样量：50“L。742质谱参考条件a)离子化方式：电喷雾电离；b)扫描方式：负离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d)离子源温度：350；3GBT 22963-2008e)雾化气压力：0083 MPa；f)气帘气压力：0124 0
13、MPa；g)辅助气1压力：0275 6 MPa；h)辅助气2压力：0241 2 MPa；i)喷雾器电流：一5”A；j)电喷雾电压：一4 500 V；k)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表l。表1 5种激素及代谢物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化合物名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 碰撞气能量V 去簇电压v32062772 42 110玉米赤霉醇 3211277232111610 40 10031871608 40 一110玉米赤霉酮 3187160831871070 45 11032291599 50 90n一玉米赤霉烯醇一4氘代 3229159932
14、291301 43 9026692510 35 90己烯雌酚 2667251026692371 40 一9026472491 36 80双烯雌酚 2647249126472360 36 8026901189 23 70己烷雌酚 269。01340269O1340 52 7027502589 37 90己烯雌酚一8氘代 275 02589275o2450 42 90743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士25之内；且样品谱图
15、中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 i0K20 K10允许最大偏差 土20 士25 士30 507432定量测定配制系列混合基质标准工作溶液(71)分别进样，绘制标准工作曲线。检查仪器性能，确定线性范围。用色谱数据工作站或选取与样品含量接近含有内标的标准工作液进行定量。样品溶液中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的响应值应在工作曲线范围内。标准物质多反应监测(MRM)色谱
16、图参见附录A中的图A1。本方法中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。475平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。8结果计算GBT 22963-2008玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的测定结果按式(1)计算：x一会昙等磊V獬(1)式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；毛基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；ci试样溶液中内
17、标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；“基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A，基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值；玉米赤霉醇和己烯雌酚将2种异构体面积或峰高值相加后以总量计算。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，鱼肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、已烯雌
18、酚、己烷雌酚、双烯雌酚的添加浓度范围及重复性方程见表3。表3 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R玉米赤霉醇 1O10 lg r一0965 619m一1089 7 lgR一0962 5190 712 8玉米赤霉酮 1010 lg r-0966 Olgm一1144 5 lgR一0915 219m一0651 3己烯雌酚 1010 lg r-0984 419，一1093 5 lgR=0205 819m+0011 9双烯雌酚 1010 lg r一0073 5lgm+O001 6 IgRI081 319m一0798 2己烷雌酚 1010 lg
19、 r一0976 019m一1044 5 lgR=0925 219m一0661 3注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，鱼肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚的添加浓度范围及再现性方程见表3。GBT 22963-2008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱圈玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。亡坦型罾 2。_， ，L【巴=，辫50e4L L 一I，=i 墨oo
20、 Li-而1了i-iF五了了-Fi_i1F瓦了irLL一L=毋 暑oo L、i1了1了1了古再丽石石基I赢丽而雨两雨而一rL一一：L 从=：一：撂。L=一一一一i一一一JL一一一一一一：一0 5 1 0 1 5 20 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 7 5 8 0 85岂趔捌罾6：剽 L t=：o o L，jJl-一图A1 玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚标准物质多反应监测(MRM)色谱图附录B(资料性附录)回收率GBT 22963-2008本方法中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚添加浓度殛其平均回收率的试验数据化合物名称 添加浓度(,-gkg) 平均回收率10 9l 792 o 1088玉米赤霉醇50 1062100 79361o 105 12o 103 4玉米赤霉酮5 o 1064100 10331o 87442o 9853己烯雌酚5o 869910o 89071O 100320 9479双烯雌酚5o 8219100 950710 7095Z0 8496己烷雌酚50 8217100 9575
