1、lCS 67050X 04 a亘中华人民共和国国家标准GBT 22973-2008牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱一串联质谱法Determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrolacetate residues in milk and milk powderHPLCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀粥鬻瓣警襻瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 吾GBT 22973-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准
2、由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王传现、唐毅锋、方晓明、盛永刚、庞国芳。牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22973-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮(melengestrol acetate)、醋酸氯地孕酮(chlormadinoneacetate)和醋酸甲地孕酮(megestroI acetate)残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和
3、醋酸甲地孕酮残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮检测限均为2 pgkg；奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮的检测限均为20 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，IS0 57251：199
4、4，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，IsO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理从牛奶样品中提取脂肪后，用乙腈提取，皂化后，经氰丙基型固相萃取柱净化，C。色谱柱分离，液相色谱一串联质谱检测，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。41水：GBT 6682，一级。42乙腈：色谱纯。43甲醇：色谱纯。44乙酸乙酯：色谱纯。45正己烷：色谱纯。46氯化镁(M
5、gCl：6H：O)。47氢氧化钠。4，8甲酸。49 25氨水。410 95乙醇。411石油醚。4，12无水硫酸钠。1GBT 22973-2008413 乙酸乙酯+正己烷(1+19)：量取10 mL乙酸乙酯(44)与190 mL正己烷(45)混合。414 乙酸乙酯+正己烷(1+4)：量取40 mL乙酸乙酯(44)与160 mL正己烷(45)混合。415 10 molL氯化镁溶液：称取203 g氯化镁(46)，用水溶解并定容到100 mL。416 01 molL氢氧化钠溶液：称取100 g氢氧化钠(47)，用水溶解并定容到250 mL。417乙腈+水(7+3)：量取700 mL乙腈(42)与300
6、 mL水混合，摇匀。418标准物质：醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮，纯度97。419 1 000-gmL标准储备溶液：准确称取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准物质(418)各0050 0 g于50 mL容量瓶中，用甲醇(43)溶解并定容至刻度。标准储备溶液于4保存。420 100 pgmL混合标准溶液I。分别吸取100 mL醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液(419)于100mL容量瓶中，用甲醇定容。该混合标准溶液于4保存。42I 10-gmL混合标准溶液。取10mL混合标准溶液I(420)于100mL容量瓶中，用甲醇定容。该混合标准溶液于4保存。422基
7、质混合标准工作溶液：根据需要，取适量的混合标准溶液(421)，用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准溶液。标准工作溶液现用现配。423氰丙基固相萃取柱或相当者：3 mL500 mg。使用前分别用5 mL乙酸乙酯和6 mL正己烷淋洗，保持柱体湿润。424滤膜：022m。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52分析天平：感量01 mg和001 g。53氮气浓缩仪。54固相萃取装置：配有真空泵。55低温离心机：一5至室温，最大转速5 000 rrain。56液体混匀器。57恒温水浴。58微波炉。59 移液器：10 pL100 pL和100 pL1 000 pL。6试
8、样制备与保存61试样的制备取样品500 g搅拌混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。62试样的保存如果制备好的试样不立刻测定，则将测试样置于4中保存。7测定步骤71样品称量711牛奶样品称取lo g(精确到001 g)牛奶样品，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中。712奶粉样品称取1 g样品(精确到001 g)，置于50 n1L具塞聚丙烯离心管中，然后加入8倍质量的水溶解后混匀。72样品提取加10mL氨水(49)，混匀。加入10mL 95乙醇(410)，混匀后加入10mL乙酸乙酯(44)，振摇1 min，再加入10 mL石油醚(411)，同样振摇1 min，以4 000 rmin离心5
9、rain，吸取上层提取液通2GBT 22973-2008过装有15 g无水硫酸钠的玻璃柱过滤到50 mL具塞聚丙烯离心管中。再用8 mL乙酸乙酯(44)和8 mL石油醚(411)重复提取残液一次，以4 000 rmin离心5 rain，提取液过相同的无水硫酸钠的玻璃柱，用5 mL乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱后，合并提取液，提取液于60用氮气浓缩仪吹干。加入5 mL乙腈，于60水浴中保持3 rain，使脂肪融化。涡旋1 min，于一5以4 000 rmin离心7min，吸取上清液至15mL具塞聚丙烯离心管中，再向沉淀物中加入5mL乙腈重复提取一次，合并上清液。向合并的乙腈提取液中加入2 mL正己烷(
10、45)，涡旋1 rain，于一5以4 000 rmin离心5 min，弃去正己烷层，再用2 mL正己烷重复洗涤乙腈相，弃去正己烷层。乙腈提取液于60用氮气浓缩仪吹干。73皂化向乙腈提取液(72)中依次加入4 mL正己烷(45)、1 mL氢氧化钠溶液(416)和05 mL氯化镁溶液(415)，于液体混匀器上快速混匀10 s，在60水浴中保持15 min，于5以4 000 rmin离心5 min，吸取上清液至15 mL离心管中。向沉淀物中再加入4 mL正己烷，混匀，于60水浴中加热15 min后，于一5以4 000 rmin离心5rain，合并上清液。于60用氮气浓缩仪吹干，用10mL正已烷溶解残
11、渣，待净化。74净化将上述样液(73)移人氰丙基固相萃取柱中(423)，用2 mL正己烷分两次润洗玻璃试管，洗液也移人固相萃取柱中。待样液流出后，依次用5 mL正己烷和6 mL乙酸乙酯+正己烷溶液(1+19)(413)淋洗固相萃取柱，淋洗液流出后，固相萃取柱抽干2 min，最后用35 mL乙酸乙酯+正己烷溶液(1+4)(414)洗脱，洗脱液收集于另一15 mL离心管中，于60用氮气浓缩仪吹干。残余物用1 mL乙腈+水(7+3)(417)涡旋溶解，过滤膜，供液相色谱一串联质谱测定。75测定条件751液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：c。8柱，3 pm，50 mm20 mm(内径)
12、或相当者；b)柱温：30；c)流速：03 mLmin；d)进样量：10 pL；e)梯度洗脱，洗脱程序见表1。表1 液相色谱梯度洗脱程序时间rain 01甲酸水溶液 乙腈含01甲酸0 90 101O 20 8070 20 8080 90 10752质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：正离子电喷雾；b)扫描方式：多反应检测MRM；c)电喷雾电压：4 000 V；d)离子源温度：350；e)雾化气、气帘气、辅助气：均为高纯氮气，使用前调节各气流流量，以使质谱仪灵敏度达到检测要求；f)定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表2。GBT 22973-2008表2定性离子对，定量离子对，去簇电
13、压和碰撞能量化合物名称 定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 去簇电压v 碰撞能量V397337 120 5醋酸美仑孕酮 397337397279 120 28405345 80 6醋酸氯地孕酮405345405309 80 13385325 130 6醋酸甲地孕酮 385325385267130 16753液相色谱一串联质谱测定7531定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准溶液中对应物质的保留时间偏差在士25之内且样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超
14、过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许相对偏差 土20 士25 30 土507532定量测定在仪器最佳工作条件下，用混合基质标准校准溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准物质的多反应检测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1、图A2和图A3。本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B1。76平行试验
15、按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。77空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定按式(1)计算：xc羔舞UU m 1 U式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。492重复性在重复性试验条件下，获得的
16、两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛奶中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度范围及重复性方程见表4，奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度范围及重复性方程见表5。表4牛奶中三种孕酮的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为毫克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R醋酸美仑孕酮 00020020 lg r-0757 6lgm一0952 7 lgR-0972 5190 518 7醋酸氯地孕酮 00020020 lg r一0886 8lgm 0 908 4 lgRO931 4lgm 0494 2醋酸甲地孕酮 00020020 lg r一0871 8
17、lgm一0905 9 lgR=0896 4 lgm一0497 6注：仇为两次测定值的平均值。表5奶粉中三种孕酮的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为毫克每千克化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R醋酸美仑孕酮 00200200 lg r一0933 6lgm一0972 4 lgR=0987 6lgm 0546 0醋酸氯地孕酮 00200 200 Ig r一0 681 4lg0 4461 lgR=0916 6 Igm一0 423 5醋酸甲地孕酮 00200200 lg r一0 987 6lg优0979 8 lgR一0963 6 lgm 0552 5注；m为两次攫5定值的平均值。如果两次
18、测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度范围及再现性方程见表4，奶粉中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度范围及再现性方程见表5。GBT 22973-2008附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图醋酸美仑孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。+tM蜊癌h担图A1 醋酸美仑孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图醋酸氯地孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A2。图A2醋酸氯地孕酮
19、标准物质的多反应监测(MRM)色谱图醋酸甲地孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A3。图A3醋酸甲地孕酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图越限忡艇GBT 22973-2008附录B(资料性附录)回收率本方法中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮添加浓度及其平均回收率的试验数据样品基质 化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率20 86740 896醋酸美仑孕酮10 90220 89720 86540 878牛奶 醋酸氯地孕酮10 91020 90820 86940 871醋酸甲地孕酮10 89320 89720 88 340 897醋酸美仑孕酮100 903200 90320 88740 878奶粉 醋酸氯地孕酮100 903200 89920 87240 876醋酸甲地孕酮100 90 1200 913
