1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民共和国国家标准G/T 27529-2011 马接触传染性子宫炎诊断技术Diagnostic techniques for contagious equine metritis 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目IJi=i 本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。GB/T 27529一2011本标准起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆
2、出入境检验检疫局。本标准主要起草人:朱来华、梁成珠、郑小龙、肖西志、邓明俊、辛学谦、谭乐义、方绍庆、王宫璜、岳志芹、季新成、王群、孙涛、赵玉然。I GB/T 27529-2011 马接触传染性子宫炎诊断技术1 范围本标准规定了马接触传染性子宫炎Ccontagiousequine metritis，CEM)的诊断技术。本标准适用于马接触传染性子宫炎的诊断和检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引
3、用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 临床检查3. 1 临床特征公马感染马生殖道泰勒氏杆菌后不表现任何临床症状，当母马感染后表现阴道炎、子宫颈炎，初期外阴部出现大量渗出物或灰色炎症分泌物，后期渗出物或分泌物逐渐变成带稠的服液，其中含有大量的多核细胞、蒙古膜脱落细胞和崩解的细胞碎片。3.2 判定根据3.1临床检查可作出初步判定。为了确诊需进行实验室检查，细菌学检查是确诊本病最可靠的方法。4 病原分离与初步鉴定4. 1 材料准备4. 1. 1 器材4. 1. 1. 1 微量移液器
4、。4. 1. 1. 2 二氧化碳培养箱。4. 1. 1.3 普通冰箱及低温冰箱(4.C、一20.C)。4. 1. 1.4 离心管。4. 1. 1.5 普通生物显微镜。4. 1. 1. 6 暗视野或相差显微镜。4. 1. 1. 7 载玻片。4. 1. 1. 8 接种环。4. 1. 1. 9 擦镜纸。4. 1.2 实验室用水实验室用水是指实验室用于榕解、稀释或配制溶液的水，可用多次蒸锢或离子交换等制备，符合GB/T 6682二级水要求。4. 1.3 培养基4. 1. 3. 1 运输培养基:见附录A。4. 1. 3. 2 选择性琼脂培养基:见附录A。GB/T 27529一20114. 1. 3. 3
5、 含硫酸链霉素(200g/mL)选择性琼脂培养基:见附录A。4. 1. 3. 4 卵黄氧化铀琼脂培养基:见附录A。4. 1.4 试剂4. 1.4. 1 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。4.1.4.2 革兰氏染色液:按GB/T4789.28-2003中2.2规定配制。4. 1.4.3 过氧化物酶试验试剂:按GB/T4789.28-2003中3.18规定，临用时配制。4. 1. 4. 4 氧化酶试验试剂z按GB/T4789. 28-2003中3.20规定，临用时配制，于冰箱内避光保存。4.2 样晶采集和运送在采集泌尿生殖道拭子前应至少停用抗生素药物7d，也不得使用消毒药物冲洗泌尿生殖道。
6、母马或公马保定后，用高压消毒的棉拭子刮擦路尿生殖道蒙古膜(尿道隐窝、尿道窦、尿道或阴茎黯)以刮取含有细胞、分泌物的样品。从阴蒂窝和阴蒂窦刮取拭子进行分离培养即可证明马生殖道泰勒氏杆菌的存在，但要获得纯净的培养物，应从子宫颈或子宫内膜中采集样品来分离。公马:每匹公马分别从阴茎基部/包皮处(包皮垢)、尿道隐窝/尿道窦、尿道口采集3份拭子。未怀孕母马z每匹母马分别从子宫颈、阴蒂隐窝、阴蒂窦采集3份拭子。怀孕母马:每匹母马分别从阴蒂隐窝、阴蒂窦采集2份拭子。棉拭子采集后，迅速插入装有1mL2 mL含活性炭的运输培养基离心管内，以吸附掉细菌代谢产生的抑制因子。在低温条件(2oC8 OC)下，样品尽快(2
7、4h48 h内)送往实验室。4.3 病原分离培养样品到达实验室后，立即用棉拭子蘸取样品液直接涂布于选择性琼脂培养基和含硫酸链霉素(200g/mL)选择性琼脂培养基平板上，每个拭子均接种2个平板。平板在5%10%的二氧化碳培养箱内35C37 oc培养，最初24h应检查是否有杂菌污染。48 h后应每天观察，培养7d14 d。4.4 病原初步鉴定4.4. 1 菌落鉴定48 h后应每天观察琼脂培养基。观察培养基上有元疑似特征性菌落。马生殖道泰勒氏杆菌的菌落很小，直径2mm3 mm，边缘完整光滑，有光泽，呈浅灰黄色。如无特征性菌落，可弃之。4.4.2 革兰氏染色鉴定按GB/T4789. 28-2003中
8、2.2规定操作。4.4.3 湿片动力试验取干净载玻片一块，用微量移液器加一滴生理盐水，无菌挑取少量菌落，涂抹分散均匀。使用暗视野或相差显微镜检查，先用低倍物镜，再用高倍物镜，观察细菌形态特征与动力特征。4.4.4 生化鉴定4.4.4. 1 氧化酶试验取典型菌落，按GB/T4789.28-2003中3.18规定操作。4.4.4.2 过氧化氢酶试验取典型菌落，按GBjT4789.28-2003中3.20规定操作。4.4.4.3 磷脂酶试验用接种环挑取固体培养基上典型菌落，点种于卵黄氧化铀琼脂平板(每张平板至少可接种10点), 在5%10%的二氧化碳培养箱内37oc厌氧培养24h，观察接种点的变化。
9、磷脂酶试验阳性者产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的海浊带。2 GB/T 27529-2011 4.5 结果判定4.5.1 根据细菌的菌落特征、革兰氏染色特征、湿片动力试验、过氧化氢酶试验、磷脂酶试验和氧化酶试验的结果可进行初步鉴定。4.5.2 马生殖道泰勒氏杆菌生长缓慢，菌落很小，直经2mm 3 mm，边缘完整光滑，有光泽，呈浅灰黄色。4.5.3 马生殖道泰勒氏杆菌革兰氏染色阴性，杆状或球杆状，有时呈多形态(长达6m)，并可表现两极着色。4.5.4 马生殖道泰勒氏杆菌元运动性。4.5.5 马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化氢酶和磷酸脂酶，氧化酶强阳性，元其他生化反应。
10、4.5.6 凡符合马生殖道泰勒氏杆菌一般特征和生化特性的细菌，可初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌，如初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌，则需要进一步应用马生殖道泰勒氏杆菌特异抗血清进行血清学鉴定。5 病原血清学鉴定技术5. 1 玻片乳胶凝集试验5. 1. 1 试验材料5. 1. 1. 1 马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。5. 1. 1.2 马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳肢。5.1. 1. 3 马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳肢。5. 1. 1. 4 载玻片。5. 1. 1. 5 玻璃铅笔。5. 1. 1. 6 接种环。5. 1. 1. 7 牙签或火柴杆。5. 1.2 操作程序使用前，马生殖道泰勒氏杆菌的
11、标准抗原应充分振荡，所有试剂在室温平衡使其温度达到20.C 左右。取洁净载玻片一块，用玻璃铅笔划成小格。滴加1滴马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶(约25L)，再用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定细菌培养物适量，或滴加1滴液体培养物(约25L)。同时于载玻片另一端滴加1滴马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶，同样钩取该细菌培养物?昆匀于其中。以牙签或火柴杆混匀，在3min5 min内判定结果。5. 1.3 结果判定+: 100%凝集，全部乳胶凝集，成絮状团块，出现大的凝集片或粒状物，液体清亮。+:75%凝集，大部分乳胶凝集成较小的颗粒，有可见凝集块，液体清亮，几乎完全透明。+:50%凝集，半量乳胶
12、凝集成细小颗粒，出现比较明显的颗粒状凝集颗粒或小凝块，液体不甚透明。+ :25%凝集，仅可勉强看到粒状物，或较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体提浊。一无凝集现象，全部乳胶液体仍为均匀混浊，元颗粒。以+或以上的反应强度作为该反应滴度的终点，判为凝集试验阳性。5. 1.4 结果说明玻片乳胶凝集试验因可能出现非特异性凝集反应，仅用做马生殖道泰勒氏杆菌的初步血清学鉴定。3 GB/T 27529-2011 5.2 间接荧光抗体法5.2. 1 试验材料5.2. 1. 1 马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原。5.2. 1.2 马生殖道泰勒氏杆菌荧光标记的标准阳性血清。5.2. 1.3 马生殖道泰勒氏杆菌标准阴性
13、血清。5.2. 1. 4 异硫氨酸荧光素(FITC)标记的抗抗体诊断液。5.2. 1.5 0.1 mol/L pH8. 0磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录B)。5.2. 1. 6 甘泊缓冲液(见附录B)。5.2. 1.7 丙酣:乙醇(体积比1: 1，一200C预冷)。5.2. 1.8 恒温培养箱。5.2. 1.9 荧光显微镜。5.2. 1. 10 载玻片。5. 2. 1. 11 盖玻片。5.2. 1. 12 玻璃铅笔。5.2. 1. 13 接种环。5.2. 1. 14 慑子。5.2. 1. 15 染色缸。5.2.2 操作程序取一干净载玻片，用玻璃铅笔画定样品区域(直径0.5cm)，用接种环在琼脂
14、培养基上钩取待鉴定细菌培养物适量，涂布均匀，风干。同时以马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原作为阳性对照。待涂片似干未干时，滴加顶冷丙酣:乙晖液，固定细胞5min10 mino 用慑子将载玻片放入PBS液染色缸中充分漂洗，经过3次，每次3min5 mino 将载玻片上多余的水擦干，分别取10L马生殖道泰勒杆菌的标准阳性血清、标准阴性血清(事先用PBS稀释10倍20倍)滴于标本上，放于湿盒内，370C温育30min。将载玻片上多余的水份擦干，滴加10L异硫氨酸荧光素(FITC)标记的抗抗体诊断被(以PBS稀释至工作效价)，并使它布满整个标本。置湿盒中，放37oC温箱，作用30min，取出玻片，用PBS充
15、分漂洗，经过3次，每次3min5 mino 将载玻片上多余的水份擦干，在标本处滴一小滴甘油缓冲液，轻轻加上盖玻片。5.2.3 结果判定将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者FITC荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。5.2.4 结果说明间接荧光抗体法因特异性强、灵敏度高，可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊。6 病原套式PCR分子鉴定6. 1 材料与试剂6. 1. 1 仪器与器材6. 1.1. 1 PCR扩增仪。6. 1. 1.2 高速台式冷冻离心机(离心速度12000 r/min以上)。6. 1. 1. 3 台式离心机(离心速度2000 r/min) 0 6. 1. 1. 4 混
16、匀器。6. 1. 1.5 冰箱(2oC8 oC和一200C两种)。6. 1. 1.6 微量可调移液器及配套带滤芯吸头。GB/T 27529-2011 6. 1. 1. 7 Eppendorf管(1.5 mL带盖塑料离心管)。6. 1. 1. 8 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。6. 1. 1. 9 电泳凝胶成像系统(或紫外分析仪)。6. 1. 2 试剂6. 1. 2. 1 蛋白酶K.见附录C。6. 1. 2.2 10%SDS液:见附录ca6. 1.2.3 异丙酶z200C预冷。6. 1.2.4 NaAc(3 mol/L):见附录C。6. 1. 2. 5 75%乙醇:见附录C。6. 1. 2. 6
17、Taq酶:5U/L. 6. 1. 2. 7 10XPCR缓冲液。6. 1.2.8 dNTPs:含有dATP、dTTPdCTP、dGTP各2.5 rnmol/L. 6. 1. 2. 9 电泳缓冲液:用5XTBE电泳缓冲液稀释成工作浓度，即0.5XTBE缓冲液(见附录。6. 1.2.10 EB:见附录C.6. 1. 2. 11 加样缓冲液(6X):见附录ca6. 1.2. 12 0.1 mol/L PBS(pH8. 0):见附录B.6. 1. 2.13 引物:加灭菌蒸馆水配制成20mol/L工作液(见表1)。表1套式PCR引物序列名称序列在165rRNA位置上游外侧引物PPl 5 -CCATT A
18、GAGGCTGTT AATCAATCGGGAAACC-3 38-67 上游内侧引物PP2 5人CCATACCGAACCCAA T ACCAAGCACACAAG-3 245-274 下游引物PRl 5一GTGTCATTAAGGTGTGT ATTTGGTCTGGTG-3 482-453 6.2 DNA模板的制备取n个灭菌的1.5 mL Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)，编号。用微量可调移液器于每管加pH7.0PBS 1 mL，将生殖道拭子浸泡、挤压后，于4oc 15 000 r/m离心1min，去上清液也用微量可调移液器于每管加入
19、蛋白酶K至终浓度100g/mL和SDS至终浓度10g/L, 55 .C水浴2 h。用微量可调移液器于每管分别加入苯酷、苯醋-氯仿-异丙醇混舍液(体积比为25: 24 : 1)、氯仿，在混匀器上剧烈棍匀，各抽提1次，吸取水相转移至新Eppendorf管。用微量可调移液器及配套带滤芯吸头于每管加入1/10体积3mol/L的NaAc和2.5倍体积的元水乙醇，轻轻混匀后置一20.C沉淀1h ,4 .C条件下12000 r/min离心15min，弃掉上清液。用微量可调移液器于每管加入75%乙醇洗涤，40C条件下12000 r/min离心5min，沉淀烘干后悬浮于水中，取适量用作PCR模板。若需长期保存应
20、放置一700C冰箱。6.3 半套式PCR程序6.3.1 第一次PCR反应第一次PCR反应液组成如下:10XPCR缓冲液MgClz (25 mmol/L) dNTP(2. 5 mmol/L) 引物PP1(20mol/L)5L 4L 4L lL 5 GB/T 27529-2011 引物PR1(20mol/L) Taq酶(5U/L) 1L 0.5L DNA模板(10ng/L) 2L 水32.5L在PCR管内加入上述成分，总体积为50L，3000 r/min离心10s. 将PCR反应管置于PCR扩增仪。先95.C 5 min，再进行95.C 30 s , 58 .C 30 s、72.C 30 s，35
21、次循环，然后72.C 10 min，最后4.C保温。6.3.2 第二次PCR反应第二次PCR反应液组成如下:10XPCR缓冲液MgClz (25 mmol/L) dNTPs(2.5 mmol/L) 引物PP2(20mol/L)引物PR1(20mol/L)Taq酶(5U/p.L) 5L 4L 4L IL lL 0.5L DNA模板(10ng/L) 2L 水32.5L 第一次PCR产物在带稳压稳流电泳仪的水平电泳槽内进行琼脂糖凝胶电泳后，在电泳凝胶成像系统(或紫外分析仪)上进行观察。如果不出现445bp的DNA扩增条带，取2L产物做模板;如果电泳后出现445bp的DNA扩增条带，则需将产物按1:
22、1 000稀释后，取2L作为第二次PCR的模板。在PCR管内加入上述成分，总体积为50L，3000 r/min离心10s. 将PCR反应管置于PCR扩增仪。先95.C 5 min，再进行95.C 30 s、62.C 30 s、72.C 30 s，35次循环，然后72.C 10 min，最后4.C保温。6.3.3 对照设立从6.2DNA模板的制备开始，设立阳性对照、阴性对照。以含有己知马生殖道泰勒氏杆菌NCTC11184株的细菌悬液作为阳性对照，蒸锢水作为阴性对照。6.3.4 PCR产物琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含O.5g/mL EB)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液
23、刚好淹没胶面。将10L样品和2L加样冲液(6X)混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约30min，当澳酣蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察结果。6.4 结果判定第一次PCR后阳性对照会出现一条445bp的DNA片段。阴性对照则元。第二次(半套式)PCR后，阳性对照会出现一条238bp的DNA片段。阴性对照则元。待测样品PCR扩增后，如能在相应445bp、238bp位置上出现DNA条带，即可判定为阳性反应。必要时对扩增产物进行序列测定与比对。6.5 结果说明套式PCR技术因特异性强、灵敏度高，结合PCR序列测定、比对，亦可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊。6 A.1
24、 运输培养基氧化铀(NaCD氯化饵(KCl)氯化钙(CaClz)氯化镜(MgClz)磷酸二氢饵(KHzP04)磷酸氢二铀(NazHP04)琉基乙酸铀(CzH3 NaOZ S) 活性炭附录A(规范性附录)培养基配制方法3.0 g 0.2 g 0.1 g 0.1 g 0.2 g 1. 15 g 1. 0g 10.0 g 琼脂4.0 g GB/T 27529-2011 称取上述成分，加入蒸馆水定容到1000 mL，稍加热溶解后107.9kPa、121.C高压灭菌15mino A.2 选择性琼脂培养基:5%(体积分数)热灭活血液巧克力琼脂培养基蛋白陈牛肉浸膏氯化铀10.0 g 3.0 g 5.0 g
25、琼脂15.0 g 加入900mL蒸馆水，加热溶解后107.9kPa、121oC高压灭菌15mino冷却至70oC80 oC时，加入50mL马血液，70.C80oC水浴12min，期间不断旋摇;继续冷却到45.C50.C，加入1mL的100 mg/mL半脱氨酸(终浓度0.83mol/U、1mL的277mg/mL亚硫酸纳(终浓度1.59 mol/L)、三甲氧韦二氨嘻睫(1g/mL)、洁霉素(5g/mL)和两性霉素B(5g/mL).以灭菌蒸馆水定容到1000 mL;充分振摇，倾注平皿，厚度约为4mm，即可获得高质量的巧克力琼脂培养基。A.3 含磕睡链霉素(200g/mL)选择性琼脂培养基在5%(体积
26、分数)热灭活血液琼脂培养基的基础上添加硫酸链霉素(200g/mL)。A.4 卵黄氯化铀琼脂培养基(磷脂酶试验用)A. 4. 1 10%氧化铀卵黄班的制备取新鲜鸡蛋1个，以元菌操作取出卵黄，加入10%灭菌氯化铀溶液100mL中，充分振摇，即得。A.4.2 卵黄氧化铀琼脂培养基蛋白陈6 g 牛肉浸出粉1. 8g 琼脂23 g 氯化铀(NaCD30 g 蒸饵水650 mL 10%氧化铀卵黄液100 mL 取上述成分(除10%氯化铀卵黄液外)混合，加热溶化琼脂，调节pH值为7.6，107.9 kPa、121.C 高压灭菌15min，待冷至约60oC，以无菌操作加入10%氧化铀卵黄液100mL，充分振摇
27、，倾注平皿。7 GB/T 27529-2011 附录B(规范性附录)间接荧光抗体试剂配制方法B. 1 O. 1 moI/L磷酸盐缓冲液CP圃，pH8.0)磷酸氢二饵5.59 g 磷酸二氢饵0.41 g 取磷酸氢二饵5.59g与磷酸二氢伺0.41g，加蒸馆水定容至1000mL，充分溶解即可。B.2 甘油缓冲撞甘油90 mL O. 1 mol/L PBSCpH8. 0) 10 mL 取90mL甘油加10mL pH8. 0 PBS充分混匀，即成甘油缓冲液。8 C.1 蛋白酶K(10mg/mL) 蛋白酶K蒸锢水50 mg 5 mL 附录C(规范性附录)PCR试荆配制方法50 mg蛋白酶K溶于5mL蒸馆
28、水中，分装成每管1mL，一200C保存。C.2 10% SDS SDS(十二皖基磺酸铀)100 g 蒸馆水1000 mL GB/T 27529-2011 100 g SDS在900mL水中榕解，加热至68oc助溶，加水定容至1000 mL，室温保存。C.3 3 mol/L醋酸铀408 g醋酸铀(NaAc 3Hz 0) ，在900mL水中榕解，加水定容至1000mL，室温保存。107.9kPa、121 oc高压灭菌15min。C.4 75%Z醇蒸馆水75 mL 无水乙醇25 mL 用元水乙醇和蒸馆水充分混匀，-200C预冷。C.5 5XTBE电泳缓冲液(5X浓缩液)Tris 珊酸54.0 g 2
29、7.5 g EDTA 2.9 g 加三蒸水到1 000 mL 用5mol/L的盐酸(HCl)调到pH8.0，或直接购买商品化的产品。巳6EB(染色荆)澳化乙键(EB)100 mg 蒸锢水10 mL 用三蒸水配制成10mg/mL的浓缩液，使用时每10mL琼脂溶液中加1LoC.7 加样缓冲渡(6X) 澳酣蓝0.25 g 蔚糖40 g 蒸馆7(100 mL 称取澳酣蓝0.25g和蔚糖40g，充分溶解于80mL蒸锢水，最后定容至100mLo 107. 9 kPa、121 oC高压灭菌15mino 9 =ON|NmhNH因。华人民共和国家标准马接触传染性子宫炎诊断技术GB/T 27529-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销唔开本880X12301/16 印张1字数19千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价* 书号:155066 1-44039 GB/T 27529-2011 打印日期:2012年2月22H F002A
