1、ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 27532-2011 犬瘟热诊断技术Diagnostic techniques for canine distemper 2011-11-21发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检亵总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布前言本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。GB/T 27532-2011 本标准起草单位:青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。
2、本标准主要起草人:单虎、黄娟、熊炜、温建新、秦晓冰、朱来华、宫文妮、袁小远、孙园园、马晶。I G/T 27532-2011 犬瘟热诊断技术1 范围本标准规定了犬瘟热的临床诊断、犬瘟热病毒的病原分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RTPCR检测的操作方法。本标准适用于犬瘟热的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR检测适用于犬瘟热的病原诊断。2 试剂和材料2. 1 改良最低要素营养液(DMEM)培养基:配方参见附录A.2.2 非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。2.3 磷酸盐缓冲液(PB曰:配制参见附录A。2.4 青霉素、链霉素:配方参见附录A。2.
3、5 CDV阳性血清z中和抗体效价1: 1 024. 2.6 CDV阴性血清:无CDV感染的犬血清。2. 7 酶结合物:HRP标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)。2.8 底物溶液:配制参见附录A。2.9 过氧化氢甲醇溶液z配制参见附录A。2.10 盐酸酒精溶液:配制参见附录A。2. 11 膜蛋白酶溶液z配制参见附录A。2. 12 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/LL , -20 .C保存。2. 13 逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液z逆转录酶浓度为50U/L，-20 .C保存。2.14 RNA酶抑制剂(40U/LL):一20.C保存。2.15 dNTP:含dATP、dGTP
4、、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20.C保存。2. 16 引物:浓度为20mol/L，其序列如下:上游引物(CDVF):5 CGA GTC TTT GAG ATA GGG TT 3气下游引物(CDVR):5 CCT CCA AAG GGT TCC CAT GA 3。2. 17 随机引物:含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50mol/L，-20.C保存。2.18 DEPC水:自配(参见附录A)，或购买商品化DEPC水。2. 19 Trizol试剂:4.C保存。2.20 异丙醇z使用前预冷至一20.C。2.21 75%乙醇:用新开启的元水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20.C。2.
5、22 1. 5 mL元RNA酶的Eppendorf管。2.23 0.2 mL元RNA酶的PCR薄壁管。3 器材和设备3. 1 细胞培养瓶(中号瓶)。3.2 二氧化碳培养箱。3.3 恒温水浴箱(5.C 100 .C)。3.4 普通光学显微镜。1 GB/T 27532-2011 3.5 0.45m微孔滤膜。3.6 离心机。3.7 PCR扩增仪。3.8 水平电泳仪。3.9 40个小孔的室玻片。3. 10 冷冻切片机。3. 11 高速台式冷冻离心机:可控温至4C、离心速度可达12OOOg以上。3. 12 凝肢成像系统。4 临床检查4. 1 临床症状4. 1. 1 病犬体温升高至40.C以上，鼻流清涕至
6、服性鼻汁，服性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状。4. 1. 2 腹下可见米粒大丘摩。4. 1. 3 病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽擂。4.2 病理变化4.2. 1 新生幼犬感染CDV表现胸腺萎缩;成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。4.2.2 表现神经症状的犬可见鼻和脚垫的皮肤角化病。4.2.3 中枢神经系统的病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。4.2.4 犬瘟热病毒的包涵体呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1m5m，可在蒙古膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现，核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。4.3 判
7、定若临床症状符合4.1.1或4.1.3且出现4.2.4的病理变化，则可判定疑似犬瘟热，其他临床症状和病理变化可作为参考指标;疑似病例可采用病毒分离、免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR检测等方法确诊。5 病毒分离5. 1 样晶采集和处理5. 1. 1 活犬可采集泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬可采集肝、脾、肺等组织器官。5. 1.2 上述样品用无血清DMEM制成20%组织悬液，10000 r/min离心20min，取上清液，经0.45m微孔滤膜过滤，滤液用于CDV分离。5.2 操作方法5.2.1 细胞培养用含8%新生牛血清的DMEM培养基在细胞培养瓶(中号瓶)培养Vero细胞，置37.C二
8、氧化碳培养箱，单层细胞长至80%90%时，接种样品上清。5.2.2 病料接种取0.1mL处理好的样品上清接种Vero细胞，置37.C二氧化碳培养箱吸附1h，加入无血清DMEM继续培养5d7 d，观察结果。5.3 结果判定若接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为CDV病原分离阴性。若Vero细胞培养4d5 d出现细胞病变(如细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成合胞体，并在胞浆中出现包涵体)，可用免疫酶检测、免疫组织化学检测和RT-PCR三种方法之一进行确诊。G/T 27532-2011 6 免瘟酶检测6. 1 操作方法6. 1. 1 将CDV标准株和待鉴
9、定的样品分别接种Vero细胞，接种后5d7 d，病变达50%75%时，用膜蛋白酶消化分散感染细胞，PBS液洗涤3次后，稀释至1X 106个/mL细胞。取有40个小孔的室玻片，每孔滴加10L.室温自然干燥后，冷丙嗣(4.C)固定10min。密封包装，置一20.C备用。6. 1. 2 取出室玻片，室温干燥后，每份10倍稀释的CDV阳性血清和阴性血清，每份血清滴加到两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，置恒温水浴箱37.C孵育30min。6. 1. 3 PBS漂洗3次，每次5min，室温干燥。6. 1. 4 滴加1: 10O稀释的酶结合物，置湿盒内，用恒温水浴箱3盯7.C孵育3omin 6丘.1
10、.5PBS漂洗3次，每次5min。6. 1. 6 将室玻片放入底物溶液中，室温下显色5min 10 mino PBS漂洗2次，再用蒸锢水漂洗1次。6. 1. 7 吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。6.2 结果判定6.2. 1 若CDV阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均元色，且CDV阳性血清与正常细胞反应无色，与CDV标准毒株感染细胞反应呈棕黄色或棕褐色，则判定阴、阳性对照成立。6.2.2 在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与CDV阳性血清和阴性血清反应均呈元色，判为CDV阴性，相应动物犬瘟热感染阴性。6.2.3 在符合6.2.1的条件下，待鉴定病毒感染细胞与阴性血清反应呈
11、元色，而与CDV阳性血清反应呈棕黄色或棕褐色，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。7 免疫组织化学检测7. 1 样晶处理对疑似CD的病死犬或扑杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cmX 1 cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固定，保存，送检。7.2 操作方法7.2. 1 新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片机切片风干后用丙酣圄定10min15 min，新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片(切片应用白胶或铭矶明胶做粘合剂，以防脱)。7.2.2 去内源酶:用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精潜液37.C作用20min. 7
12、.2.3 膜蛋白酶消化:室温下，用膜蛋白酶溶液消化处理2min，以便充分暴露抗原。7.2.4 漂洗:PBS漂洗3次，每次5min。7.2.5 封闭:滴加体积分数为5%的新生牛血清或1: 10稀释的正常马血清，37.C湿盒中孵育30 min. 7.2.6 加10倍稀释的CDV阳性血清或阴性血清，37.C湿盒中孵育1h或37.C湿盒中孵育30min后4 .C过夜。7.2.7 漂洗:PBS漂洗3次，每次5min. 7.2.8 加1: 100稀释的酶结合物，37.C湿盒孵育1h. 7.2.9 漂洗:PBS漂洗3次，每次5min。7.2. 10 底物显色:新鲜配制的底物溶液显色5min10 min后漂洗
13、。7.2. 11 从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。7.2. 12 试验同时设阳性、阴性血清对照。3 GB/T 27532-20门7.3 结果判定7.3. 1 被检组织与阴性血清作用后应元着染，若出现黄色或棕褐色着染，判定阴性对照不成立，应重复实验。7.3.2 在符合7.3.1的条件下，被检组织与CDV阳性血清作用后本底清晰，细胞浆内呈现黄色或棕褐色着染，判为CDV阳性，相应动物犬瘟热感染阳性。8 RT-PCR检测8. 1 病料的采集及处理采集的样品包括犬的泪液、鼻液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15
14、min，收集上清液待检。口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。经细胞病原分离培养的样品，收集细胞沉淀待检。CDV阳性对照样品和阴性对照样品的同样处理。8.2 RNA抽提分别取100L待检样品、CDV阳性样品和阴性样品的上清液各装入1.5 mL元RNA酶的Eppendorf管，加入1mL Trizol试剂，用枪头充分吹打20次-30次;13 OOOg离心15min;取上层水相，加500L异丙醇，颠倒数次混匀，一20.C放置20min; 13 OOOg离心10min;弃上清，沉淀用1mL DEPC 水配制的75%乙醇清洗;8000g离心10min;弃上清，沉淀室温干燥10min;加2
15、0LDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液在2h内进行逆转录合成cDNA模板。另外，RNA抽提也可采用市售的商品化RNA抽提试剂盒进行。8.3 cDNA模板制备取17LRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2.5L、dNTP1. 5L、随机引物2!J.L、RNA酶抑制剂1L、逆转录酶lL，室温放置10min后，置PCR仪上经42.C、60min, 70 .C、10min. 8.4 PCR检测在0.2mL PCR薄壁管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5L、dNTP0.5L、Taq酶0.5L、cDNA模板2L、上游引物和下游引物(CDVF、CDVR)各O.5L、三蒸水18.5L，配制PCR
16、检测体系。将PCR管置PCR仪上按如下程序扩增:首先94.C变性2min;再94.C、30s , 55 .C、30s , 72.C、40s进行35个循环;最后72.C、3min.用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖平板(含O. 5g/mL EB，参见附录A中A.ll，将平板放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10LPCR产物和2L加样缓冲液(6X)棍匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5 V/cm电泳约30min，当澳酣蓝到达底部时停止，用凝胶成像系统观察结果。8.5 结果判定8.5. 1 经RT-PCR检测，CDV阳性对照样品可扩增出大小为455怜的核酸片段，且阴性
17、对照样品元扩增条带，否则试验结果视为无效。8.5.2 在符合8.5. 1的条件下，若待检样品扩增出了大小为455bp的核酸片段，则初步判定犬瘟热病毒核酸阳性;若待检样品元扩增条带或扩增条带大小不为455bp，则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8.5.3 待检样品扩增出的阳性基因片段应进行核酸序列测定，若其序列与提供的比对序列的同源性二三90%，则可确诊为犬瘟热病毒核酸阳性，否则判定犬瘟热病毒核酸阴性。8.5.4 若犬瘟热病毒核酸阳性且病原分离也呈阳性，则可判定犬瘟热病毒感染阳性。4 A.1 DMEM(高糖)培养液的配制附录A(资料性附录)试荆及其配制GB/T 27532-2011 量取去离子水950m
18、L，置于适宜的容器中。将DMEM粉剂10g加于300C的去离子水中，边加边搅拌。每1000mL培养液加3.7g碳酸氢铀。加去离子水至1000mL，用1mol/L氢氧化铀或盐酸将培养液pH值调至6.97. 0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。立即用孔径0.45m的微孔滤膜正压过滤除菌，40C冰箱保存备用。A.2 磷酸盐缓冲液(PBS，O.01 mol/L pH7. 4) 氯化铀氯化押磷酸二氢饵十二水磷酸氢二铀蒸锢水A.3 青毒素、链霉素8 g 0.2 g 0.2 g 2.83 g 加至1000mL 取注射用青霉素和链霉素溶解于三蒸水中，使每毫升含青霉素、链霉素各5万单位(g)，除菌过滤，用时按100
19、mL 1640-15培养液加0.2mL，使青霉素、链霉素的最终浓度各为100单位(g)。A.4 底物溶液3，3-二胶基联苯胶盐酸盐(DAB)PBS 丙酣30%过氧化氢滤纸过滤后使用，现用现配。A.5 过氧化氢甲醇溶液(0.3%)30%过氧化氢甲醇现用现配。A.6 盐酸酒精溶液(1%) 盐酸70%乙醇A.7 肢蛋白酶溶液(0.5%)膜蛋白酶PBS 低温保存。使用时，用PBS稀释为0.05%。40 mg 100 mL 5 mL 0.1 mL 1 mL 99 mL 1 mL 99 mL 0.5 g 100 mL 5 GB/T 27532-2011 A.8 DEPC溶液(0.1 %) DEPC 1 m
20、L 蒸馆水加至1000mL 磁力搅拌至溶解，高压灭菌121oC , 30 min后4oC冰箱保存备用。A.9 生理盐水称取9g元水氯化铀溶于1000 mL去离子水中配成0.9%生理盐水，121.3 oC灭菌15mino A.10 5XTBE电泳缓冲液每升三蒸水中加入三是甲基氨基甲皖(Tris)54.0g，乙二股四乙酸(EDTA)2.9mg，棚酸27.5g , 用5mol/L的盐酸调pH值至8.0。A.11 EB核酸染色荆在10mL三蒸水中加入100mg漠化乙键(EB)配制成10mg/mL的浓缩液。A.12 加样缓冲液(6X) 每100mL三蒸水中加入滇酣蓝0.25g和蕉糖40go 6 附录B(
21、资料性附录)犬瘟热病毒RT-PCR扩增核酸片段参考序列cgagtctttg agatagggtt catcaaacgg tggctgaatg acatgccatt actccagaca accaactata tggtcctccc ggagaattct aaagctgagg tgtgtactat agcagtgggc gagctgacac tggcttcctt gtgtgtagat gagagcaccg tattattata tcatgacagc aatggtccac atgacagtgt tctagtagtg acgctgggaa tatttggggc aacaccgatg aatcaagta
22、g aagaggtgat acctgtcgct catccatcag tagaaaagat acatatcaca aatcaccgtg gtttcataaa agattcagta gcaacctgga tggtgcctgc attggtctct gagcaacaag aaggacaaaa aaattgtctg gagtcggctt gtcaaagaaa atcctaccct atgtgcaacc aaacatcatg ggaacccttt ggagg GB/T 27532-2011 FFONlNmmhNH因。国华人民共和国家标准犬瘟热诊断技术GB/T 27532-2011 中每中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数15千字2012年1月第一次印刷开本880X12301/16 2012年1月第一版* 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44041 GB/T 27532-2011 打印日期:2012年2月22H F002A
