1、ICS 65.020.01 B 16 aB 和国国家标准11: -、中华人民GB/T 28066-2011 丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. pisi CSackett) Young et al. 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T 28066-20门目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起
2、草单位:中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:林石明、黄莲英、易建平、陈青、廖富荣、吴搓、陈红运、王宏毅。I GB/T 28066-2011 1 范围丁香假单胞杆菌豌豆致病型检疫鉴定方法本标准规定了丁香假单胞杆菌豌豆致病型生物学、血清学及分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等植物及其产品中丁香假单胞杆菌豌豆致病型的检测和鉴定。2 丁香假单胞杆菌豌豆致病型基本信息中文名:丁香假单胞杆菌豌豆致病型。中文别名:豌豆(细菌性)枯萎病菌或豌豆细菌性叶斑病菌、豌豆假单胞蔓枯病菌或茎枯病菌等。学名:Pseudomonassyringae V
3、an Hall, 1902 pv.isi (Sackett,1916) Young,Dye and Wilkie, 1978。病害英文名:bactrial blight of pea 0 异名:Bacteium pisi (Sackett) Smith, 1920; Chlorobacter pisi (Sackett) Patel &. Kulkarni, 1951; Pseudomonas pisi Sackett, 1916; Pseudomonas syringae Van Hall, 1902; Pytomonas (Sackett) Bergey, et al. ，1923。属原核
4、生物界Procaryotes，变形细菌门Proteobacteria , y-变形细菌纲Gammaproteobacteria，假单胞杆菌目Pseudomonadales，假单胞杆菌科Pseudomonadaceae，假单胞杆菌属Pseudomonas 0 丁香假单胞杆菌豌豆致病型的其他信息参见附录A。3 方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、基于体外DNA扩增技术的聚合酶链式反应(PC邸，以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4 主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂z硫酸镜、磷酸氢二饵、煎糖、甘油
5、、跚酸、氧化镜、蛋白陈、生理盐水、三氯甲皖、异戊醇、异丙醇、Tris盐酸、EDTA、SDS(十二皖基硫酸铀)、CTAB(十六烧基三甲基澳化胶)、澳化乙镜、头抱氨节、万古霉素、头抱映辛酸、澳酣蓝、放线(菌酣或制霉菌素和PCR相关试剂。5 主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器:超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统和酶标仪。1 GB/T 28066-2011 6 病菌分离6. 1 种子样品的制备检查皱缩种子和其他为害状的种子。每份种子检测样品至少检测2000粒种子。将种子倒入5L 桶内，加3L无菌水，搅拌，用无菌
6、(新的塑料袋严密封盖，4.C下静置16h18h或过夜;去掉塑料袋，充分搅拌。取种子浸出液10mL，用15000 g离心5min，用蒸懵水分2次(每次1mL)洗下沉淀物，制成种子浸出液，以备分离培养。6.2 种子中病菌的分离培养取100L的种子浸出液涂布于P3和(或)54培养基平板上培养基配制见附录B)。每个样品设3个10个重复，元菌水作为空白对照。在25.C士2.C下黑暗中培养，3d后开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1)，则将菌落转移至KB平板上划线培养1d2 d进行纯化(培养基配制见附录酌，纯化3次后进行生化鉴定、DA5-ELI5A或PCR等方法鉴定。表1培养基上的菌落特征
7、P3培养基S4培养基PSpl的菌落扁平状，白色、透明，边缘不规则多数菌株有蓝色荧光Pspi的菌落较大，半球形，白色，边缘整齐6.3 植物组织中病菌的分离培养仔细检查植物叶片、豆英等组织的症状参见图A.口，用元菌刀片将可疑的病斑切成细的切块，加一滴元菌水，置于载玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察。如果观察到细菌的菌睬，则进行分离培养。选择新鲜症状的叶片、豆英等组织，切取病斑前沿部分2mm巾7mm的组织，用70%酒精表面消毒15S，元菌水洗2次3次，在54和(或)P3培养基平板上划线分离。在25.C士2.C下黑暗中培养3d后，开始观察。如果在培养基上产生可疑菌落(菌落特征见表1)，则将菌落转移至K
8、B平板上培养1d2 d进行纯化，纯化3次后进行生化鉴定、DAS-ELI5A或PCR等方法鉴定。7 病菌鉴定7. 1 生化鉴定采用BIOLOG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7. 2 DAS-ELlSA方法将可疑菌落配制成104CFU/mL悬浮液，取100L悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用己知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。2 GB/T 28066一20门7.3 PCR方法将可疑菌落制备成108CFU/mL的细菌悬浮液，进行PCR扩增。或者把可疑菌落接种到NB培养基中(培养基配制见附录B), 25 oc士2oc下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的DNA，进行
9、PCR扩增。用己知菌株作阳性对照，用元菌水作空白对照。具体操作步骤见附录D。7.4 致病性测试如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果。将豌豆种子播种于小盆钵中，待长出2片3片真叶的小苗。取在KB培养基上培养24h48 h 的菌落，用消毒的昆虫针蘸取菌落，在最为幼嫩的秸轩处进行刺伤接种。每个菌落接种5株小苗。5 d7 d后，观察是否产生致病性。如果出现扩展型的水渍状病斑，则有致病性;反之，则没有致病性。注:有些Pspi的菌株在接种1d2 d后，就引起小苗倒伏。8 结果判定与栓测报告8.1 结果判定8. 1. 1 未分离到
10、可疑菌落如果经S4或P3培养基分离培养，7d后仍未产生可疑菌落，则未检出Pspi。8. 1.2 分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、DAS-ELISA或PCR方法检测，并通过致病性测试的确认。一一如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果产生阳性，致病性测试也产生典型症状，则判定为检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型;一如果生化鉴定、DAS-ELISA检测或PCR的结果为阴性，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型;一一如果生化鉴定、DAS-ELISA或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，而致病性测试为阴性，则应重新进行致病性测试。致病性重新测试后，如
11、果仍然未产生典型症状，则判定为未检出丁香假单胞杆菌豌豆致病型。8.2 检测报告检测报告应包含所采用检测方法所产生的数据，包括DAS-ELISA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片、PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等。3 GBjT 28066-2011 附录A(资料性附录)丁香假单胞杆菌豌豆致病型相关资料A.1 寄主植物自然寄主:豌豆CPisum sativum)、扁豆CDolichos lablab)、香豌豆CLathyrusodoratus)和野豌豆CVicia sepium , V. benghlensis)等。接种寄主:天蓝盲宿CMedicagolupulina)、虹豆C
12、V.ung出culata)和菜豆CPhaseolusvulgaris)等。A.2 传播途径病菌通过种子进行远距离传播。病菌在种子表面或种子内部至少存活10个月，在田间病残体上存活几个月，在干燥的种子上可以保持活性3年以上。即使只有0.01%的种子带菌率，也会引起病害发生，产生严重为害。病残体也是侵染源。在大田，病茵通过雨水的飞溅、风和人工或机械传带而扩散。A.3 症状特征豌豆植株所有的地上部分均会产生症状，包括叶柄、复叶、托叶、茎、卷须、花芽和豆英，其中在茎轩和托叶上的症状最为明显。发病严重的田块颗粒无收，一般损失在20%以下。在干燥且偶有霜睐的天气条件下，症状通常出现在士表的茎部，其上形成水
13、渍状病斑，后期呈橄榄色至紫褐色。病斑向上发展，侵染复叶和托叶，使叶脉变成褐色至黑色，周围组织发病形成扇形图案，脉间组织变成水渍状，并逐渐变黄色至褐色，最后叶片干枯呈纸质状。在多雨的条件，复叶和豆英上会出现病斑，初期为圆形或卵圆形或不规则的水渍状小斑点，呈暗绿色;斑点扩大后相互融合成较大的病斑，但是只限于脉间。在病斑表面可能出现乳白色的菌睐，干燥后有亮光。在叶片和托叶上，最初症状为小的、暗绿色水渍状病斑。病斑经常扩展并融合，但是均会受到叶脉的限制。在小叶上，病斑发黄，后变褐色，而呈薄纸状。复叶后期变黄，病斑呈褐色纸状。茎轩上的病斑向托叶和小叶扩展，在托叶上产生伞形病斑。受侵染的叶脉变黑褐色，叶片
14、组织变成黄色至褐色，干枯后变薄纸状结构。茎轩上的病斑可能融合，引起萎缩死亡。在果英上，病斑凹陷，橄榄褐色;在近土表的茎秤上也会产生病斑，最初病斑呈水渍状，而后变榄绿色至暗褐色。发病的豆英成熟后扭曲，病斑下陷，呈暗绿色。豆英上的病斑只限于缝隙处的一条窄带。发病的种子在种脐周围形成水渍状的斑点，或呈皱缩状，褐黄色。出苗前后可发生瘁倒，而后植株死亡。严重者种子变色，但多数种子表面没有明显症状。一般只在潮湿的季节或受霜害之后才发生该病害。在潮湿、雨后或重露水的生长季节，易于侵染;潮湿季节发病最重。大降雨加上雨水或重露水极其有利于病菌的扩散。受霜冻或大雨损害的植株最容易发病。Pseudomonassyr
15、ingae pv. pisi和Pseudomonass.)盯咆aepv. syrigae所产生的症状相似，难于区别。4 GB/T 28066-2011 图A.l豌豆细菌性枯萎病的症状A.4 地理分布非洲:马拉维、肯尼亚、摩洛哥、南非、坦桑尼亚、津巴布韦等。美洲:巴西、百慕大、加拿大、墨西哥、美国、阿根延、乌拉圭等。亚洲:印度尼西亚、以色列、日本、黎巴嫩、尼泊尔、叙利亚、印度等。欧洲z保加利亚、丹麦、英国、法国、德国、希腊、荷兰、匈牙利、意大利、罗马尼亚、瑞士等。大洋洲:澳大利亚、新西兰等。5 GB/T 28066-2011 附录B(规范性附录)培养基的配制B.1 KB培养基(改良KB培养基，K
16、ing，etaI. , 1954) 称取以下试剂:3号阮蛋白陈20.0g、磷酸氢二拥(KzHP04)1.5g、硫酸镜(MgS04 7HzO) 1. 5 g、甘油15.0mL、琼脂15.0g，倒入适宜的容器内，加1000 mL蒸锢水，溶解所有的试剂。在121oc下湿热灭菌15min;冷却至45oC50 oC后，加入头抱氨韦(Cephalexin)50 mg(溶解于75%的酒精中，配制成25X 10-6浓度h缓慢地倒入培养皿内(每个直径9cm的培养皿20mL)，避免产生气泡。培养基在超净工作台凝固后直接使用，或者反扣过来装入塑料袋中，在40C下保存。最长的保存时间是2周3周，否则抗生素会失效。B.
17、2 S4培养基称取1-糖50g、棚酸1.5g和琼脂15.0g，榕解于1000 mL的蒸锢水中，在121oC下湿热灭菌15 min，冷却至500C加入制霉菌素(Nystatine)或放线菌酣(溶解于30mL 70%酒精中配制成母液)。B.3 P3培养基称取甘油10g、跚酸1.5 g和PseudomonasF琼脂38g，溶解于1000mL的蒸锚水中，在121oC下湿热灭菌15min，冷却至50oC加入制霉菌素(Nystatine)或放线菌酣(溶解于30mL的70%酒精中)。B.4 NB(Nutrient Broth)培养基蛋白陈5.0g，牛肉浸膏3.0g，蒸榴水1000 mL, 121 oC湿热灭
18、菌15min 6 GB/28066-20门C.l 包被附录C(规范性附录)DAS-ELISA方法用碳酸铀缓冲液稀释抗体溶液(如1: 200)，在微孔板中每孔加入100L包被抗体溶液。在室温下孵育2h4 h或4oc下包被过夜。C.2 捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液，用PBS-Tween洗4次5次孔(或在洗板机上完成)。加入菌悬液或样品提取液到酶标板的孔中，每孔100L，每个样品2个孔(重复1次)。并设置阳性和阴性对照。在室温下孵育2h或4oc下过夜。C.3 加入酶标抗体根据说明用酶标抗体缓冲破稀释相应的酶标抗体(如1: 200)。倒去孔中的样品提取液，用PBSTween洗4次5次孔(可在洗板机上
19、完成)。每孔加入100L酶标抗体溶液。在室温下孵育2h。C.4 加底物用二乙醇股缓冲液(pH9.8)配制1mg/mL的对础基苯磷酸醋的底物溶液。倒去酶标抗体溶液，用PBS-Tween洗4次5次孔(可在洗板机上完成。每孔加入100L新鲜配制的底物溶破。室温下避光放置，直至阳性对照孔明显显色(约30min60 min)。C.5 读数用酶标仪在405nm处读吸光值。C.6 结果判定C. 6.1 对照孔的OD405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即z一二缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值2;一二同一样品的OD405值应基本一致。C. 6. 2 在满足了C.6.1质量要求后，
20、结果原则上可判断如下z一一样品OD405值/阴性对照OD削值明显2，判为阳性;一一样品OD4Q5值/阴性对照OD4Q5值在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证;一样品OD4Q5值/阴性对照OD4Q5值明显2，判为阴性。C.6.3 若满足不了C.6.1质量要求，则不能进行结果判断。7 GB/T 28066一2011D.1 PCR模板的制备D. 1. 1 菌悬液PCR模板的制备附录D(规范性附录)PCR方法取3L的108CFU/mL(ODsoo =0.1)的菌体悬浮液，转入装有100L元菌双蒸水的1.5L离心管中，在99.C水浴10min, 10 000 g离心10min，冷却后，取
21、上清液作为PCR反应模板。D. 1.2 DNA的提取取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液，10000 g离心2min，提取沉淀的DNA;或者取0.1 g的发病植物组织，研磨后，提取植物总DNA.提取步骤根据商用试剂盒说明进行。D.2 51物序到用于检测Pspi的特异性引物及其序列见表D.1，经合成纯化后，冻干备用。表D.1用于PCR扩增的引物及其序列寻!物名称引物序列扩增产物EFEPl 5 -ACGCTGGGATGTT ACTTG-3 303 bp EFEP2 5 -GCCTGTTCAAAACGTGTG-3 D.3 PCR反应50L反应体系中加入:10XPCR缓冲液(含MgC12)5.0L
22、，10 mmol/L的dNTP混合物1.0L，TaqDNA聚合酶(5U/L) 0.5L，10mol/L的上下引物各2.0L，DNA模板2L，去离子水补足至50L。在PCR仪上完成以下程序:95.C预变性3min;然后94.C变性1min、60.C退火1min、72.C延伸1 min，共30个循环;最后在72.C下保持10min D.4 电泳分新取5L扩增产物与1L的6X上样缓冲液混合均匀，在0.5XTBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶中，4V/cm6 V/cm电泳50min，澳化乙链(EB)染色后在凝胶成像系统中观察，拍照并保存。G/T 28066-20门D.5 结果判定在阳性对照扩增出预期大
23、小的条带(约303bp)，阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条件下:一-如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阳性;一如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带，则PCR检测结果为阴性。9 FFONl8NH阁。华人民共和国家标准丁香假单胞杆菌豌豆致病型检症鉴定方法GB/T 28066-2011 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X 1230 1/16 印张1字数17千字2012年5月第一版2012年5月第一次印刷唔书号:155066. 1-44582 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28066-2011 打印H期:2012年5月22日F002
