1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/ T 1870-2007 食品中致病菌检测方法实时PCR法Detection of pathogens in food - Real-time PCR Method 2007-04-06发布2007-10-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检亵总局SN/T 1870-2007 前言本标准的附录A、附录B均为规范性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准主要起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验
2、检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:曹际娟、卢行安、肖性龙、李苏龙、孙杰、李丽、许业莉、顾鸣、谢昭聪、朱海、张经纬.本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准.I SN/ T 1870- 2007 食品中致病菌检测方法实时PCR法1 范围本标准规定了食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157: H7、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的实时PCR检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性弧菌的快速检测.2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引
3、的修改单(不包括勘误的内容)或修是否可使用这些文件的最新版本.GB/ T 6682 分析实验室用水GB 19489实验室生物安SN 0170 出口食品中沙门氏菌检验方法SN 0172 出口食品中金黄色葡萄SN 0173 出口食品中副溶血性SN 0174 出口食品中小肠结SN 0175 出口食品中空肠弯SN/ T 0184.1 进出口食品SN/ T 0973 进出口肉及肉SN/ T 1022 出口食品中霍乱3 定义、术语和缩畸语嘀嘀下列定义、术语和缩略语适用于本标准。3. 1 定义和术语3. 1. 1 实时荧光PCRreal-time f1 uorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。3
4、. 1.2 Ct值cyclethr臼boldCt 每个反应管内的荧光信号达到设定的阑值时所经历的循环数。3.2 缩畸语3.2. 1 PCR polymerase cbain reaction 聚合酶链反应，简称PCR。炎耶尔森氏菌、单核细胞增生菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻1 SN/T 1870-2007 样品的模板DNA进行实时PCR扩增，观察实时PCR的增幅曲线，从而对食品中的致病菌进行快速检测。4.2 设备和材料4.2. 1 实时PCR仪。4.2.2 离心机。4.2.3 微量移液器和灭菌吸头:10L，100L，200L，1000L。4. 2. 4 恒温培养箱。4.2.5 恒温水浴锅。4.2
5、.6 天平。4. 2. 7 均质器或乳钵。4.2.8 灭菌三角烧瓶:500rnL,250 mL。4.2.9 灭菌吸管:10 mL. 4.2.10 灭菌平皿:90mmX15 mm。4.2. 11 灭菌试管:内径3mm，长5cm. 4. 2. 12 接种棒、镇锚丝。4.2. 13 试管架、试管篓。4. 2.14 废液缸。4. 3 试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.3. 1 7j(:应符合GB/T6682中一级水的规格。4. 3.2 Taq DNA聚合酶。4.3.3 dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP.4.3.4 DN
6、A提取试剂:称取O.1 g chelex 100粉末，加入100mL灭菌蒸馆水中，摇匀即可，也可使用商业化的DNA提取试剂盒。4.3. 5 10XPCR缓冲液:200 mmol/ L Tris-HCl (pH8. 4) , 200 mmol/L氯化饵(KCD15 mmol/L氯化楼(MgC12)。4.3.6 引物和探针:引物和探针序列见表A.1，其中探针的5端标记FAM，3端标记TAMRA。4.4 检测步骤4.4. 1 样晶制备、增菌培养和分离沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0170进行。金黄色葡萄球菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0172进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的样品
7、制备、增菌培养和分离步骤参照SN0174进行。食品中单核细胞增生李斯特氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T0184. 1进行。空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0175进行。肠出血性大肠杆菌0157: H7的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T0973进行。副溶血性弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN0173进行。霍乱弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照SN/T1022进行。创伤弧菌和溶藻弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照NMKLNo.156进行。4.4. 2 模极DNA的制备4.4.2. 1 增菌液模板DNA的制备取4.4.1中培养的相应致病菌增菌液(
8、需二次培养的则取二次增菌液)1 rnL，加到l.5 mL无菌离心管中，8000 r/min离心5min，吸弃上清;力口人50LDNA提取液使用前室温解冻并充分混句，快速吸取)，混匀后沸水浴5min, 12 000 r/min离心5min，取上清保存于一20C备用以待检测。3 SN/ T 1870一20073.2. 2 DNA deoxyribonuleic acid 脱氧核糖核酸.3.2. 3 dNTP dxyribonuclside tripbpbate 脱氧核昔酸三碗酸.3. 2. 4 dA TP deoxyadenosine tripbosphate 脱氧腺背三磷醺.3.2. 5 dCT
9、P deoxycytidine triphosphate 脱氧胞背三磷酸。3. 2. 6 dGTP deoxyguanosine triphphate 脱氧鸟昔三磷酸。3. 2. 7 dTTP deoxythymidine triphosphate 脱氧胸昔三磷酸。3. 2. 8 dUTP dxyuridine triph倒phate脱氧鸟背三磷酸.3. 2.9 UNG uracil N-glycosylase 尿嘻院N-糖基化酶.3. 2. 10 Taq Thermus aquaticu 水生栖热菌.3. 2. 11 Tris tris (hydroxymethyl) aminomethan
10、e 三经甲基氨基甲烧.3. 2. 12 F AM 6-carboxyfloor臼ceinG援基荧光素.3. 2. 13 TAMRA 6-carboxytetramethylrhodamine G援基四甲基罗丹明.4 测定方法4. 1 方法提要在PCR基础上，加入一条与模板DNA匹配的、两端有荧光基团标记的寡核背酸探针oPCR每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系.当荧光信号超过所设定的阑值(Threshold-value)时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加理可以间接地体现目的片段的扩增量.SN/T 1870-2007
11、4.4.2.2 可疑菌落模扳DNA的制备挑取4.4.1中分离到的可疑菌落或菌体，加入50LDNA提取液，再按照4.4.2.1步骤制备模板DNA以待检测。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNAo4. 4.3 实时PCR检测4.4.3. 1 反应体系体积为25L:10 X PCR缓忡液2.5L、引物对(10mol/L)各1L、dNTP(10 mmol/L) 1L、TaqDNA聚合酶(5U/ f.lL)O. 5L、水17L、棋板DNA2Lo 4. 4.3.2 反应条件:3TC5 min，95C预变性3min，94C变性5s，60C退火延伸40s，同时收集FAM荧光，进行40个循环，
12、4C保存反应产物。注:PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整-4.4.3.3 检测过程中分别设阳性对菌株DNA，空白对照为元菌水。的生化鉴定和报告.6 测定低限在上述条件下，本方法对于各亵的阳性克隆分子DNA或阳性5 结果及判断5. 1 质控标准一一阴性对照:无扩增曲线，C，注40;一一阳性对照:出现典型的扩增曲线，否则，实验视为无效。5.2 结果判定和报告菌;致病菌名称抄门氏菌测定低限/(CFU/mL)57 : H7 291 志贺氏菌200 金黄色葡萄球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌单核细胞增生李斯特氏菌空肠弯曲菌84 500 2 500 菌一菌弧一弧伤-藻创潜500 1 000 5
13、00 7 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录Bo8 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置.并参见GB19489中的有关规定执行.4 致病菌名称沙门氏菌志贺氏窗金黄色葡萄球菌小肠结肠炎耶尔森氏菌单核细胞增生李斯特氏菌空肠弯曲菌胁出血性大肠埃希民菌0157 :日7副黯血性弧菌霍乱弧菌创伤弧菌搭穰弧菌SN/ T 1870-2007 附录A(规范性附录食品中致病菌实时PCR检测所周引物和探针序列表A.l食品中致病菌实时PCR栓测所用引物和探针序列引物序列-._ 5-GCCGT
14、TCCAGAGTCATA 5人AGCAATGGAAAAAGCAGCATG-35 -CGCAA T ACCTCCCG A TTCC-3 探针序列5 -CA TTTCTT AAACGGCGGTCTCTTTCCCT-3 TGTTTCCGATGCAACCT-3 AACCTTT A TGCCTTCCTCCTCGCTG-3 TATCCTAATTTA-3 (MGB) ACGGCTGA-3 AGG-3 5 SNjT 1870-2007 附景B(规范性附景检测过程中防止交叉污染的措施B. l 抽样和制样过程抽样和制样工具必须清洗干净，经121C高压灭菌15min- 20 min.一套洁净工具限于一份样品使用.存
15、放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器.8.2 检测过程.8.2. 1 实时PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区(反应混合物配制区)、PCR区检测区).将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增等步骤分区或分室进行.实验室的运作应从净区到脏区单向进行。B. 2.2 实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。B.2.3 各区所有的试剂、器材(尤其是移液器、仪器都应专用，不得带出该区。B. 2.4 所有溶液、水、耗材和器具要121C、15min高压，避免核酸和或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸锚的双蒸水.在20C-25C贮存的试剂中，可加入0.025%的叠氮锅.所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。8. 2.5 DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶.8.2.6 前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应各组分。8.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。8.2.8 可使用UNG酶和dUTP系统控制污染.8.2.9 应遵循PCR操作的其他要求.6
