1、ICS 67.120.01 B 45 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1847 2020 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Detection of Procapra Gutturosa - Derived Materials 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 1847 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国二连海关。
2、本标准主要起草人： 王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、寇福军、张志峰、荆文魁、常鸿。 DB15/T 1847 2020 1 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本 标准规定了 动物源性产品中 黄羊 源性成分 实时荧光 PCR检测 方法 。 本标准 适用于动物 源性产品（肉制品、皮毛类产品、饲料等）中黄羊 源性成分的鉴定 ，灵敏度为 0.001ng/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检
3、验 总则 GB/T 5009.1 食品卫生检验方法 理化部分 总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技 术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 。 3.2 EDTA 乙二胺四乙酸 。 3.3 Real time PCR 实时荧光定量聚合酶链式反应。 3.4 Tris-HCl 三氨基甲烷 。 4 设备 4.1 实时荧光 PCR 检测系统。 4.2 高速台式冷冻离心机（最高转速 12000 rpm 以上）。 4.3 离心机 。 4.4 旋涡 振荡器 。 DB15/T 1847 2020
4、2 4.5 单孔道微量移液器和枪头： 0.5 L 10 L、 10 L 100 L、 20 L 200 L、 100 L 1000 L。 4.6 EP 离心管。 4.7 刻度量筒： 100 mL， 500 mL， 1000 mL。 4.8 试剂 瓶和洗涤瓶： 500 mL。 4.9 天平。 5 试剂与材料 5.1 水：符合 GB/T6682 分析实验室二级水规格。 5.2 试剂盒：按说明书使用试剂盒提供的相应试剂。 5.3 自备的试剂： CTAB 提取缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵）， CTAB-沉淀液，蛋白酶 K（ 1.2 mol/L） 氯化钠。 5.4 实时荧光预混液。 5.5 引物对序列
5、-上游： 5 -CTAGGCAACATGCATATC-3 -下游： 5 -CGAGAAGAGAAATCCTTG -3 -探针序列： 5 -FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TAMRA-3 5.6 质控物质 5.6.1 阳性对照样品：采用已知含有 黄羊 源性成分的样品 或经测序确认的阳性质粒。 5.6.2 阴性对照样品：采用已知不含有 黄羊 源性成分的样品 。 5.6.3 空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。 6 实验方法 6.1 样品的选取与制备 动物源性食品按照 GB/T 5009.1 和 GB 4789.1 采样。将实验室样品研磨待用。 6.2 样品 DNA 的提取 参
6、照附录 A中方法提取样品基因组 DNA，也可采用商品化的组织基因组 DNA提取试剂盒进行。 当 A260 /A280比值 在 1.7 1.9之间时，适宜于 PCR扩增。 除检测样品外，需要设立阴性、阳性及空白对照。 6.3 实时荧光 PCR 检测 6.3.1 反应体系 反应体系体积为 25 L，体系组成见表 1。 DB15/T 1847 2020 3 表 1 黄羊源性成分实时荧光 PCR检测方法的反应体系 试剂名称 贮备液浓度 mol/L 反应体系体积 L PCR 反应预混合液 12.5 上游引物（ F） 10 1 下游引物（ R） 10 1 探针（ P） 10 1 模板 2 双蒸水 补足至总
7、体积为 25 6.3.2 反应条件 预变性： 94 ， 10 min；变性： 94 ， 15 s；延伸退火： 58 ， 1 min， 40 个循环。在 58 时收 集荧光信号值。 6.3.3 检测过程 分别设阴性 对 照、阳性对照和空白对照。 7 结果判定与表述 7.1 质量控制 7.1.1 一般要求 实验中设置的各种对照 PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果， 应重做试验。 7.1.2 核酸提取空白对照和 PCR 扩增试剂空白对照 检测结果 Ct 40.0 7.1.3 PCR 扩增阴性目标 DNA 对照 检测结果 Ct 40.0 7.1.4 PCR 扩增阳性目
8、标 DNA 对照 检测结果 Ct 35.0 7.2 结果判断和报告 7.2.1 样品 2 个平行样检测结果 Ct 40.0，同时各 种试验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性， 报告未检出黄羊源性成分。 7.2.2 样品至少 1 个平行样检测结果 35.0 Ct 40.0，并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结 果正常，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct 40.0 并出现典型 的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分； 再次检测结果仍然 Ct 40.0 同时各种试验对照结果正常，可以判断样品未检出黄
9、羊源性成分，报告未 检出黄羊源性成分。 DB15/T 1847 2020 4 7.2.3 样品 2 个平行样品检测结果 Ct 35.0 并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可 以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分。 8 防止交叉污染措施 按照 GB/T 19495.2 防止检测过程中交叉污染。 DB15/T 1847 2020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 样品 DNA 的提取及溶液配制 A.1 CTAB-提取缓冲液 将 5 g CTAB， 20.45 g NaCL， 3.03 g Tris， 1.86 g Na2-EDTA溶于 200 mL水中，用盐酸调 p
10、H 8.0后， 定容至 250 mL， 115 高压 15 min。 A.2 CTAB-沉淀液 称 0.2 g CTAB， 0.234 g NaCL，定容至 100 mL， 115 高压 15 min。 A.3 蛋白酶 K 按试剂说明配制。 A.4 1.2 mol/L NaCL溶液 称取 28 g NaCL，定容至 400 mL， 115 高压 15 min。 A.5 DNA提取方法 A.5.1 称取样品 0.5 g 1 g加入 1.5 mL 3.5 mL CTAB提取液中，再加入 12 L 20 L蛋白酶 K（根据 CTAB量调节），每个样品提取 2管，同时用水做空白对照。混匀后 65 至少
11、 1 h(过夜孵育最 好 )，如样 品膨胀，则可再多加 CTAB，每次多 1 mL，最多 10 mL。 A.5.2 低温 4000 rpm 5000 rpm离心 10 min。 A.5.3 将上清（约 1 mL）加入无菌 EP中（ 2 mL管），加入 700 L氯仿，旋涡 30 s后，再 12000 rpm离 心 10 min。 A.5.4 取上清 600 L 650 L加入无菌 EP中，加入 2倍体积的 CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置 1 min。 A.5.5 12000 rpm离心 10 min，去上清。沉淀溶解于 350 L的 1.2 mol/L NaCL溶液。（ 2管合并共用 35
12、0 L溶液）。 A.5.6 加入 350 L氯仿，涡旋 30 s，再 12000 rpm离心 10 min。 A.5.7 取上清液至无菌 EP管中（确定体积），加入 0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少 20 min,12000 rpm离心 10 min，去上清，沉淀用 500 L 75%的乙醇洗涤，再 12000 rpm离心 10 min。 A.5.8 去上清后，干燥沉淀， 60 下 15 s 20 s（开盖倒立）。 A.5.9 将沉淀溶于 100 L灭菌水或 TE Buffer或 DEPC水中。 B DB15/T 1847 2020 6 附 录 B （资料性附录） 黄羊源性成分的目标扩增序列大小 94bp CTAGGCAACATGCATATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATGACCATGCCGCGTGAAACCAACAACCCGCTCGGCAAGGATTTCTCT TCTCG _
