1、 ICS 67.050 B 45 天 津 市 地 方 标 准 DB12 DB12/T 653 2016 鲜 冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光 PCR 法 Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 653 2016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由 天津市农村工作 委员会 提出 。 本标准起草单位： 天津市农业质量标准与
2、检测技术研究所 、 天津市东丽区产品质量监督检验所 。 本标准主要起草人： 赵新、易萌、 刘娜 、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、 王成 、徐石勇 。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 DB12/T 653 2016 1 鲜冻畜、禽肉 中动物源性成分的定量检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了 鲜冻畜、禽肉中 动物源性成分 （包括 牛、羊、猪、鸡、鸭等 ） 的 定量 PCR 检测 方法的 术语和定义、检测方法、结果 计算 。 本标准适用于 生鲜、冷 冻畜禽肉中 动物源性成分 的定量 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅
3、注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR real time PCR 实时荧光 PCR 是指 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个 PCR 过程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct 值 cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 3.3 内参基因 reference gene 能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等） 。 3.4
4、 牛源性成分 bovine-derived materials 牛 种属特异性 DNA 片段。 3.5 羊源性成分 ovine-derived materials 羊 种属特异性 DNA 片段。 3.6 猪源性成分 porcine-derived materials 猪 种属特异性 DNA 片段。 3.7 鸡源性成分 chicken-derived materials 鸡 种属特异性 DNA 片段。 3.8 鸭源性成分 duck-derived materials 鸭 种属特异性 DNA 片段。 DB12/T 653 2016 2 4 原理 根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的 DNA 特征序列，筛选种
5、间保守区域设计一对通用引物 和种内特异性区域设计五对种属特异性引物 ， 通用引物可 同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性 DNA， 采用 TaqMan 实时荧光 PCR 技术，根据标准 参照物 模板含量与 Ct 值间的线性关 系，绘制标准曲线，计算试样中 种属特异性基因 和内参基因 的比值，从而对 鲜冻畜、禽肉中 动物源性成分 进行定量检测。 5 检测 方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1.1 DNA 提取用试剂 三氯甲烷 ； 异戊醇 ； 乙酸钠 ； 无水乙醇 ； Tris 饱和酚 ； 裂解液： 10 mmoL
6、/L Tris-HCl（ pH 8.0） ，25 mmol/L EDTA（ pH8.0） ， 5 g/L SDS， 0.1 g/L 蛋白酶 K； TE 缓冲液（ Tris-HCl、 EDTA 缓冲液）： 10 mmoL/L Tris-HCl（ pH 8.0）， 1 mmol/L EDTA（ pH8.0）。 5.1.2 TaqMan 荧光 PCR 反应试剂盒 5.1.3 引物和探针。 表 1 动物源性成分 内 参 基因和 种属特异性 基因引物 和探针 序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 16SrDNA 16S-F： 5- ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA -3 16S
7、-R： 5- GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3 16S-P： 5- FAM- ACTTGTATGAATGGCCGCACGAGGGTT -TAMRA-3 82 bp 内参 基因 Rd1 Rd1-F： 5-GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAG -3 Rd1-R： 5-GGCCAGACTGGGCACATG -3 Rd1-P： 5- FAM - CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-BHQ1-3 95 bp 牛 源基因 OA-PRLP OA-F： 5-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3 OA-R： 5-GGAACTGTAGCCTTCTGACT
8、CG-3 OA-P： 5- FAM-GAGACTGGCGGGGAAGGAAAGGCA-TAMRA-3 88 bp 羊 源基因 Sus-ACTB Sus-F： 5-GGAGTGTGTATCCCGTAGGTG -3 Sus-R： 5-CTGGGGACATGCAGAGAGTG -3 Sus-P： 5- FAM - TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG -BHQ1-3 103 bp 猪 源基因 Chk Chk-F： 5-CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT -3 Chk-R： 5-GTCATAGCGGAACCGTGGATA -3 Chk-P： 5- FAM- CTATGAATCCGGG
9、CCTC -TAMRA-3 62 bp 鸡 源基因 Duc Duck-F： 5-AAGCCTTCCTCTAGCTCAGC -3 Duck-R： 5- AGAAAATGCTTTAGTTAAGTC -3 Duck-P： 5- FAM- CTCAGCCGCTTAAACAACGC -TAMRA-3 80 bp 鸭 源基因 用 水 分别将上述引物 和探针 稀释到 10 mol/L， 探针需避光保存。 预期扩增片段信息参见附录 A， TaqMan 探针引物其 5端标记荧光报 告基团（如 FAM、 ROX 等）， 3端标记对应的荧光淬灭基团（如TAMRA、 BHQ1 等）。 5.1.4 阳性对照 用已知含相
10、应动物源性成分的样品作阳性对照 。 DB12/T 653 2016 3 5.1.5 双蒸水。 5.2 仪器 荧光定量 PCR 扩增仪 ； 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 ； 分析天平， 感量 0.1 g 和 0.1 mg； 离心机：离心力 12000 g； 微量移液器： 0.5L 10L， 10L 100L， 10L 200L， 100L 1000L；实时荧光 PCR 反应管 ； 重蒸馏水发生器或纯水仪 ； 恒温水浴箱 。 5.3 分析 步骤 5.3.1 试样 制备 生鲜肉直接进行试样制备，冷冻肉于室温融化后进行制样。充分混匀，用四分法缩分出不少于 500 g 作为试样，装入清洁容器中，加封后
11、，标明标记。将试样于 -20冷冻保存。 5.3.2 DNA 提取 取待测样本 剔去动物组织中的结缔组织和脂肪，液氮预冷 后 放入 研钵中，然后缓 慢 向研钵中加入液氮，迅速研磨，直到样品成细微的粉末状为止，取 100 mg 加入 2 mL 灭菌离心管中；加入 500 L 10% SDS 裂解液和 20 L 蛋白酶 K（ 20 mg/mL） ，混匀， 55水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至溶液透 明；将消化后的组织裂解液加入等体积的 Tris 饱和酚，缓慢颠倒混匀， 12000 rpm 离心 10 min，转移上清至一新离心管，重复 1 次；加入 0.5 倍体积的 Tris 饱和酚和 0.5
12、 倍体积的氯仿 /异戊醇（ 24:1），缓慢颠倒混匀， 12000 rpm 离心 10 min，转移上清至一新离心管；加入 0.1 倍体积的乙酸钠溶液和 2.5倍体积 4预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，可见白色 DNA 絮状沉淀析出， -20 沉淀 2 h； 12000 rpm离心 5 min，加入 500 L 70%乙醇洗涤沉淀；室温下放置使残余乙醇完全挥发，加 入 100 L TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。 5.3.3 标准曲线样品制备 采用 牛、羊、猪、鸡、鸭相应 的标准品绘制 种属 特异性 基因 和 16SrDNA 内 参 基因的标准曲线。提取 动物源性成分 标准物质基因组 DNA，用
13、 0.1TE 或水稀释梯度稀释 ， 标准溶液至少涵盖 5 个 动物源性成分 浓度梯度。 5.3.4 PCR 反应 5.3.4.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应， 每个 PCR 反应设置 3 次 平行 。 动物源性成分 种属 特异性基因 实时荧光 PCR 反应 按表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀 ； 16SrDNA 内 参 基因实时荧光 PCR 反应 按表 3 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀。 将 PCR 管放在离心机上， 500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行
14、实时荧光 PCR 反应。反应程序为： 95 变性 2 min；进行 45 次循环扩增反应（ 95 变性 15 s， 60 退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（ 60 ）时段收集荧光信号。 DB12/T 653 2016 4 表 2 动物源性成分 种属 特异性基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L 正向引物 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L 反向引物 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L 探针引物 0.4 mol/L 1.0 L DNA 模板 1.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应
15、体系做适当调整。“ ”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 表 3 16SrDNA 内参基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L 16S-F 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L 16S-R 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L 16S-P 0.2 mol/L 0.5 L DNA 模板 1.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“ ”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水
16、的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 5.3.4.2 设置对照 应设置阴性对照和空白对照。 以鲑鱼精子 DNA 作为阴性对照 PCR 反应体系的模板用纯水作为空白对照 PCR 反应体系的模板。 各对照 PCR 反应体系中，除模板外其余组分及 PCR 反应条件与 5.3.4.1相同。 5.3.5 数据分析 5.3.5.1 设定阈值 实时荧光 PCR 反应结束后，以 PCR 刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间重复性良好。 5.3.5.2 记录 Ct 值 设定阈值后，荧光定量 PCR 仪
17、的数据分析软件自动计算每个反应的 Ct 值，并 记录。 5.3.5.3 绘制标准曲线 根据标准溶液的扩增 Ct 值和初始模板 含量 的对数间的线性关系，分别绘制 动物源性成分 种属 特异性基因 和 16SrDNA 内 参 基因的标准曲线。 DB12/T 653 2016 5 标准曲线公式： 式中： y 测试样品的 Ct 值； a 标准曲线的斜率； x 模板靶标浓度以 10 为底数的对数； b 标准曲线的截距。 5.3.5.4 数据可接受的标准 动物源性成分 种属 特异性基因 阴性对照和空白对照的 Ct 值 38； 16SrDNA 阴性对照和空白对照的 16SrDNA 内标基因 Ct 值 38；
18、 标准曲线的 R20.98，标准曲线 斜率 -3.6 且 -3.1， 满足 上述 条件，可以进行结果计算 。否则重新进行实时荧光 PCR 扩增。 5.3.5.5 含量计算 5.3.5.5.1 计算试样模板 靶标浓度 将试样的 动物源性成分 种属 特异性基因 和 16SrDNA 内 参 基因的 Ct 值分别带入 动物源性成分 种属特异性基因 和 16SrDNA 内参基因 的标准曲线方程，计算 动物源性成分 种属 特异性基因 和 16SrDNA 内参基因 的 靶标浓度 。 计算试样模板 靶标浓度 公式： abyn 10(2) 式中： n 模板 靶标浓度 y 测试样品的 Ct 值； a 标准曲线的斜
19、率； b 标准曲线的截距。 5.3.5.5.2 计算试样中 动物源性成分 种属 特异性基因 含量 将 动物源性成分 种属 特异性基因的 靶标 浓度 和 16SrDNA 内参基因的 靶标浓度 带入 公式（ 3），计算 出试 样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的 公式 ： (3) 式中： c 试样中 动物源性成分 种属 特异性基因 的百分含量 (%)； n OA-PRLP（ Rd1、 Sus-ACTB、 Chk、 Duc） 动物源性成分 种属 特异性基因 靶标浓度 ； n16SrDNA 内 参 基因 16SrDNA 浓度 。 6 结果分析与表述 6
20、.1 16SrDNA 内 参 基因和 动物源性 种属 特异性基因 均出现典型 扩增 曲线 ，且 16SrDNA 内参基因 和 动物源性 种属 特异性基因 的 Ct 值 36， 表明样品中检出 某 动物源性成分 。 表 述为“样品中检测出 某 动物源性成分 ， 某 动物源性成分 含量为 c”。 DB12/T 653 2016 6 6.2 16SrDNA 内参基因 出现典型扩增曲线，且 Ct 值 36， 动物源性 种属 特异性基因 Ct 值 36 或未出现典型扩增曲线 ， 表明样品中未检出 某 动物源性成分 。 表 述为“样品中未检测出 某 动物源性成分 ”。 6.3 16SrDNA 内参 基因
21、和 动物源性 种属 特异性基因 出现典型扩增曲线， 16SrDNA 内参基因 Ct 值 36，动物源性 种属 特异性基因 Ct 值在 36 38 之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合 6.1-6.2 的情况，依照 6.1-6.2 进行判断；如重复实验 动物源性 种属 特异性基因 出现典型扩增曲线，但 Ct 值仍在 36 38之间，则判定样品检出 某 动物源性成分 ，表述为“样品中检测出 某 动物源性成分 ” 。 6.4 16SrDNA 内参基因 和 动物源性 种属 特异性基因 未出现典型扩增曲线，或 Ct 值 38， 表明样品中未检出 动物源性成分 。 表 述为“样品中未检测出 动物源性
22、成分 ”。 6.5 16SrDNA 内参基因 和 动物源性 种属 特异性基因 出现典型扩增曲线，但 Ct 值均在 36 38 之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合 6.1- 6.4 的情况，依照 6.1- 6.4 进行判断；如重复实验 16SrDNA内参基因 和 动物源性 种属 特异性基因 出现典型扩增曲线，但 Ct 值仍在 36 38 之间，则判定样品检出某 动物源性成分 ，表述为“样品中检测出 某 动物源性成分 ”。 DB12/T 653 2016 7 附录 A （ 资料性附录 ） A.1 牛 种属 特异性基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 1 GTAGGTGCAC AGTAC
23、GTTCT GAAGCTACTT CTGTGAGGCA GATGCCAAAC GGCACACTCG 61 GCTGTGTTCC TTGCCGTCAT GTGCCCAGTC TGGCC 注 ： 划线部分为 Rd1-F 和 Rd1-R 引物序列 ， 方框内为探针 Rd1-P 序 列。 A.2 羊 种属 特异性基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 1 CCAACATGCC TTTAAACCCT CAAAAACCAT TGAGACTGGC GGGGAAGGAA AGGCAGCCAA 61 ACAGAGCGAG TCAGAAGGCT ACAGTTCC 注：划线部分为 OA-F 和 OA-R 引物序
24、列，方框内为探针 OA-P 序 列。 A.3 猪种属 特异性基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 1 GGAGTGTGTA TCCCGTAGGT GCACAGTAGG TCTGACGTGA CTCCCCGACC TGGGGTCCCC 61 AGCACACTTA GCCGTGTTCC TTGCACTCTC TGCATGTCCC CAG 注 ： 划线部分为 Sus-F 和 Sus-R 引物序列 ， 方框内为探针 Sus-P 序 列。 A.4 鸡 种属 特异性基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 1 CCCTCCTCCT TTCATCCTCA TTTCTATGAA TCCGGGCCTC ATATCCACGG TTCCGCTATG 61 AC 注：划线部分为 Chk-F 和 Chk-R 引物序列，方框内为探针 Chk-P 序 列。 A.5 鸭 种属 特异性基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 1 AAGCCTTCCT CTAGCTCAGC CGCTTAAACA ACGCAAAACT AAAGAATCCC ACTAATTAAG 61 ACTTAACTAA AGCATTTTCT 注：划线部分为 Duck-F 和 Duck-R 引物序列，方框内为探针 Duck-P 序 列。 _
