1、ICS 67.100.01 X 16 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35322019 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Identification of caprine，sheep and bovine derived materials in goat or sheep milk Real-time fluorescent PCR method 2019 - 03 - 21发布 2019 - 04 - 21实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 35322019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义
2、 . 1 4 原理 . 1 5 试剂和材料 . 1 5.1 试剂 . 2 5.2 材料 . 2 6 仪器设备 . 2 7 检测用引物和探针 . 3 8 试验步骤 . 3 8.1 取样 . 3 8.2 DNA 提取 . 3 8.3 实时荧光 PCR 检测 . 3 9 试验数据处理 . 4 9.1 PCR 有效性判定 . 4 9.2 检测结果分析和表述 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 4 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 . 5 附 录 B （资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列 . 7 DB37/T 35322019 II 前
3、 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。 本标准主要起草人：胡悦、范阳阳、刘艳艳、张全芳、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕 步迅。 DB37/T 35322019 1 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本标准规定了羊奶产品中羊、牛源性成分的实时荧光定性 PCR检测方法。 本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、牛源性成分的定性检测。 本方法的检出限为0.1 %。 2 规范性引用文件 下
4、列文件对于本文件的应用是必不可 少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 羊源性 本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊。 3.2 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR 进程，对未知模板进行定性或 定量分析。 3.3 Ct值 cycle thres
5、hold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用 TaqMan实时荧光 PCR技术进行扩增，根据 PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定羊和牛的源性成分。 5 试剂和材料 DB37/T 35322019 2 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 氯化钠（NaCl）。 5.1.2 浓盐酸（HCl ）。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（ Tris base）。 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠（ Na2E
6、DTA2H2O）。 5.1.5 十二烷基硫酸钠（SDS ）。 5.1.6 磷酸盐缓冲液（ PBS）。 5.1.7 异硫氰酸胍（GuSCN ）。 5.1.8 硅珠（ silica）。 5.1.9 蛋白酶冻干品。 5.1.10 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X- 100）。 5.1.11 无水乙醇。 5.1.12 Chelex-100 树脂。 5.2 材料 5.2.1 生理盐水：称取 0.85 g 氯化钠加 20 mL 水溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸汽压（ 121 ）灭菌 20 min，降至室温， 4 保存备用。 5.2.2 20 mg/mL
7、蛋白酶 K 溶液：称取 0.2 g 蛋白酶冻干品，转移至 10 mL 容量瓶中，加水定容 至刻度， 分装后于-20 保存。 5.2.3 5 %的 Chelex-100：称取 5 g Chelex-100 树脂，转移至 100 mL 容量瓶中 ,加水定容至刻度。 5.2.4 1 mol/L Tris-HCl（ pH 6.4）溶液：称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 水，用浓盐酸调节 pH 至 6.4，转 移 至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸 汽 压（ 121 ） 灭菌 20 min，室温保存待用。 5.2.5 0.
8、5 mol/L EDTA（pH 8.0 ）溶液：称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中，加 入 80 mL 水 ，用 10 %的氢氧化钠溶液，调节 pH 至 8.0，转 移 至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸汽压（ 121 ）灭菌 20 min，室温保存待用。 5.2.6 10 % SDS：称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中，转移至 100 mL 容量瓶中，加水 定容至刻度，储存于灭菌过的容器中待用。 5.2.7 DNA 结合液：称取 60 g 异硫氰酸胍，加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl（p
9、H 6.4 ）溶液，再加入 8 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠（ pH 8.0） 溶液，再加入 4 mL 聚乙二醇辛基苯基醚原液（温度 60 ）， 转移至 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。 5.2.8 TE 缓冲液：将 0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠 (pH 8.0) 加入到 50 mL 的容量瓶中，调节 pH 至 8.0，转移至 50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度， 103.4 KPa 蒸汽压（ 121 ）灭菌 20 min，降至室温，4 保存备用。 6 仪器设备 6.1 实时荧光
10、定量 PCR 仪： 4 通道以上。 6.2 电子分析天平：感量 0.1 mg。 6.3 离心机：最大离心力不小于 13 000 g。 6.4 振荡型恒温金属浴： 0 100 。 DB37/T 35322019 3 6.5 高压灭菌锅。 6.6 低温冰箱： -20 4 。 6.7 超净工作台。 6.8 微量移液器：100 L 1 000 L，10 L200 L， 2 L20 L，0.5 L10 L。 6.9 容量瓶：10 mL ，50mL，100mL 。 7 检测用引物和探针 内标引物探针序列及羊和牛的引物和特异性探针序列见附录A 中表A.1 。引物探针在序列中的位置参 见附录 B。 8 试验步
11、骤 8.1 取样 首先收集白细胞：取液态羊奶2 mL ，或者奶粉 20 mg溶于2 ml 无菌 水中，每个样品设立2个平行样 , 将样品于4 、 2 500 g离心 30 min；弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部 加l mL pH 7.4灭菌的 PBS缓冲液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至 1.5 mL的离心管中，离心力3 500 g ， 常温离心10 min ，弃去上层液体，保留底部沉淀。 8.2 DNA提取 8.2.1 向收集的白细胞中加入 280 L 5 %的 Chelex-100 和 20 L 20 mg/ml 蛋白酶 K， 56 保温 30 min 以上；高速震荡
12、 5 s10 s ，100 煮沸 8 min；高速震荡 5 s 10 s， 13 000 g 离心 3 min，转移上 清液至离心柱中，13 000 g 离心 1 min，收集上清液。 8.2.2 向收集液体中加入 20 L 硅珠悬浮液和 600 L DNA 结合液，充分混匀， 65 水浴 15 min，中 间反转 3 5 次；室温放置 5 min，中间反转 3 5 次；4 000 g 离心 1 min，弃上清，留管底沉淀。 8.2.3 加入 500 L 70 % 乙醇，于 8 000 g 离心 1 min，重复此步骤 2 次；加入 500 L 无水乙醇； 吹打悬浮， 8 000 g 离心 1
13、 min，弃上清。 8.2.4 于 8 000 g 离心 30 s， 吸走残余液体，室温干燥 10 min，使残余乙醇挥发干。 8.2.5 加 100 L TE 缓冲液溶解 DNA，加入 1 L RNA 酶溶液， 55 水浴 5 min， 8 000 g，离心 1 min， 吸取上清液转移至新的离心管中，-20 保存备用。 8.2.6 紫外分光光度计检测提取的 DNA 浓度与纯度，测定 260 nm 和 280 nm 处吸光值 A260/A280，比值在 1.71.9 之间， DNA 浓度约为 0.1 ng/L50 ng/ L。 8.3 实时荧光PCR检测 8.3.1 试样实时荧光PCR检测
14、多重实时荧光PCR ：进行羊和牛源性成分多重实时荧光 PCR， PCR反应体系中包含羊和牛2 个物种源性 的特异探针，并加入内标质控体系。反应体系见附录A 中表 A.2。 8.3.2 对照实时荧光PCR反应体系 每个PCR 反应设置 3次平行。在试样 PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照： a) 空白对照：以水作为空白对照； b) 阴性对照：以 2 个动物之外的其他基因组 DNA 为阴性对照； DB37/T 35322019 4 c) 阳性对照：将羊和牛 2 种动物基因组 DNA 等量混匀作为阳性对照。 8.3.3 实时荧光PCR反应体系配制 按照附录A 中表A.2 依次加入试剂
15、，配制 PCR反应体系，混匀离心分装至PCR 反应管中，加入模板 DNA， 3 000 g离心 1 min，取出PCR 管，放入荧光定量 PCR仪中。 8.3.4 实时荧光PCR反应程序 95 预变性 3 min； 95 变性10 s，62 退火延伸 35 s，40 个循环。 9 试验数据处理 9.1 PCR有效性判定 空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明 PCR体系有效： a) 空白对照：无 JOE 和 ROX 荧光信号，或 Ct 值 40.0，有 CY5 质控探针荧光信号，且 Ct 值35.0 ； b) 阴性对照：无 JOE 和 ROX 荧光信号的 S 型扩增曲线，或 Ct
16、值 40.0，有 CY5 质控探针的荧光 信号，且 Ct 值 35.0； c) 阳性对照：有 JOE、 ROX 和 CY5 荧光信号的 S 型扩增曲线，且 Ct 值35.0 。 否则判定为 PCR无效。 9.2 检测结果分析和表述 9.2.1 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 JOE、ROX 、CY5 荧光 S 型扩增曲线出现，若 Ct 值 35.0， 则判定样品中检出相应的牛或羊源性成分；若无 S 型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。 9.2.2 在 PCR 反应体系有效的情况下，当有 JOE、 ROX、 CY5 荧光扩增曲线出现，但 35.0Ct 值 40.0， 则需要加大
17、模板量进行 PCR 反应 。若再次扩增后的 Ct 值 40.0，则判定样品中检出相应的源性成分； 若再次扩增后无 S 型扩 增曲线，则判定样品中未检出相应的源性成分。 9.2.3 对样品检测结果的判定，见附录 A 中表 A.3。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 防治污染的措施按GB/T 27403规定执行。 DB37/T 35322019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定 A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 实时荧光定性PCR 引物和探针序列见表A.1 。 表A.1 实时荧光定性PCR引物和探针序列 引物探针名称 缩写 序列
18、(5 -3) 扩增片段(bp) 通用引物- 上游 UNF AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA 228 241 通用引物- 下游 UNR GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA 内标引物- 上游 IMF ACCGTTACCGAGTCCAGGTG 134 内标引物- 下游 IMR TTCGGACTCGATCAGAGCAC 羊源性探针 Y-P 5ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3Dabcyl 牛源性探针 N-P 5JOE-ACAATCTCCATGAGTTGGTAGTTTCGG-3BHQ2 内标探针 IACP 5CY5-CGACGGTCCTT
19、TCTAATGTTGCGTCG-3Dabcyl A.2 实时荧光PCR反应体系 实时荧光定性PCR 引物和探针序列见表A.2 。 表A.2 多重实时荧光PCR反应体系 试剂名称 组分名称 加量（L ） 终浓度 2TaqManMaster Mix 2 TaqMan Master Mix 10 1 10 Primer Mix UNF/ UNR 2 0.25 mol/L IMF/R 0.10 mol/L 10 Probe Mix Y-P(ROX) 2 0.10 mol/L N-P(JOE) 0.05 mol/L IMP(CY5) 0.05 mol/L 内标质粒 1 10 -3 ng/L DNA 模板
20、 2 150 ng/ L ddH2O 补至 20L A.3 对各种样品检测结果的判定 DB37/T 35322019 6 对各种样品检测结果的判定见表 A.3。 表A.3 实时荧光PCR定性检测方法各种实验结果的判定 JOE 荧光 ROX 荧光 CY5 荧光 结果判定 Ct35 Ct35 多重 PCR 体系 检出牛源性成分 未检出牛源性成分或含 量低于检测界限 多重 PCR 体系 检出羊源性成分 未检出羊源性成分或含 量低于检测界限 多重 PCR 体系 检出牛和羊源性成 分 未检出牛和羊源性成分 或含量低于检测限 多重 PCR 体系 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测 实际样品时只有 C
21、Y5 荧光检出，无 JOE、 ROX 荧光检出，判定为未检出牛和羊源性成分。 多重 PCR 体系 PCR 反应失败。注意以下几个方面后再次进行 反应。 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则 可能是样品 DNA 制备有问题，如样品中可能存 在抑制物等。 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常， 则可能是实验操作失败或试剂失活。 DB37/T 35322019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列 B.1 山羊（Capra hircus）PCR产物序列（GenBank:KY523511.1） 山羊（ Capra hircus）PCR产物序列（ GenBank:KY523
22、511.1） AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTAAGGGATAACAACATCCTTTATGG ACTAGCAGTTTTGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAAGAGATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTTACAAGTCAAATCAAATTATC GCTTATTGATCCAAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATC B.2 绵羊（Ovis aries）PCR产物序列（GenBank:KP702285.1） 绵羊（ Ovis
23、aries） PCR产物序列（ GenBank: KP702285.1） AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTATGA GTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAAACCATC GCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATC B.3 牛（Bostaurus）PCR产物序列（Ge
24、nBank:KT827216.1） 牛（ Bostaurus）PCR 产物序列（ GenBank: KT827216.1） AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACCAACCCAAAGAGAATAAATTTAACCATTAAGGAGTAACAACAATCTCCATGA GTTGGTAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAATAAAAAACCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACCCACAAGTCAAATCACTCTATC GCTCATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATC B.4 内标序列 内标序列 ACCGTTACCGAGTCCAGGTGAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGACGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCGA GAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGTGCTCTGATCGAGTCCGAA 注：下划线为引物位置，阴影部分为探针位置。 _
