1、 ICS 67.050 B 23 天 津 市 地 方 标 准 DB12 DB12/T 6522016 转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种定性检测 实时荧光 PCR 法 Detection of genetically modified plants and derived products Qualitative PCR method for herbicide-resistant soybean DAS-68416-4 and its derivates 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 65220
2、16 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由 天津市 农村工作 委员会 提出 。 本标准起草单位： 天津市农业质量标准与检测技术研究所 、 中国农业科学院生物技术研究所、 天津市东丽区产品质量监督检验所 。 本标准主要起草人： 兰青阔、 李亮、 赵新、 刘雪岩、 宛煜嵩 、 王成、 陈锐 、 朱珠 、 刘娜 、 徐石勇 。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 DB12/T 6522016 1 转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种定性检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 转 化体
3、特异性的定性 PCR 检测方法 的 术语和定义、检测方法 、结果 分析与表述 。 本标准适用于 转基因 耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种，以及制品中 DAS-68416-4 转化体成分 的定性 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 农业部 1485 号公告 4 2010 转基因植物及其产品 成分 检测 DNA 提取和纯化 农业部 2031 号公告 8 2013 转基因 植物
4、及其产品成分检测 大豆 内标准基因定性 PCR 法 农业部 2031 号公告 19 2013 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 农业部 2031 号公告 8 2013 界定的以及 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。 3.2 DAS-68416-4 转化体 特异性序列 event-specific sequence of DAS-68416-4 DAS-68416-4 外源插入片段 5端与大豆基因组的连接区序列。 4 原理 根据 转基因耐除草剂大豆 DAS-684
5、16-4转化体特异性序列设计特异性引物，对试样 DNA进行 PCR扩增。依据是否 扩增 获得典型的实时荧光扩增曲线，判断样品中是否含有 DAS-68416-4 转化体成分 。 5 检测 方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1.1 TaqMan 荧光定量 PCR 反应试剂盒。 5.1.2 引物和探针。 DB12/T 6522016 2 5.1.2.1 Lectin 基因。 lec-1215F： 5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3 lec-1332R： 5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3 lec
6、-1269P： 5-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3 预期扩增片段大小为 118 bp（参见附录 A） 。 5.1.2.2 DAS-68416-4 转化体特异性序列。 DAS-68416-4-F： 5- GGGCCTAACTTTTGGTGTGATG - 3 DAS-68416-4-R： 5- TACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATT - 3 DAS-68416-4-P： 5 - HEX-TTCAAGCACCAGTCAGCAT-MGB- 3 预期扩增片段大小为 128 bp（参见附录 A） 。 用 水 分别将上述引物 和探针 稀释到 1
7、0 mol/L。 探针需避光保存。 5.2 仪器 分析天平： （ 感量 0.1 g 和 0.1 mg） ； 荧光定量 PCR 扩增仪 ；核酸定量仪； 重蒸馏水发生器或纯水仪 ； 其他相关仪器设备。 5.3 分析 步骤 5.3.1 抽样 按 NY/T 672 和 农业部 2031 号公告 192013 规定 执行。 5.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和 农业部 2031 号公告 192013 规定 执行。 5.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告 4 2010 规定 执行。 5.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告 4 2010 规定 执行 。 5.3.5 P
8、CR 反应 5.3.5.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应， 每个 PCR 反应设置 3 次 平行 。 DAS-68416-4 转化体实时荧光 PCR 反应 按表 1 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀 ； Lectin内标基因实时荧光 PCR 反应 按表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂 ， 混匀。 将 PCR 管放在离心机上， 500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行实时荧光 PCR 反应。 反应程序为： 94 变性 5 min；进行 45 次循环扩增反应（ 94 变性 15
9、s， 60 退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（ 60 ）时段收集荧光信号。 （ 可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。 ） DB12/T 6522016 3 表 1 DAS-68416-4 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L DAS-68416-4-F 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L DAS-68416-4-R 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L DAS-68416-4-P 0.4 mol/L 1 .0 L DNA 模板 2.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调
10、整。 “”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。 表 2 Lectin 内标 基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L lec-1215F 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L lec-1332R 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L lec-1269P 0.2 mol/L 0.5 L DNA 模板 2 .0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。 “”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积
11、，并相应调整水的体积，使反应体系 总体积达到 25.0 L。 5.3.5.2 设置对照 在试样 PCR 反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 以非转基因 大豆 基因组 DNA 作为阴性对照；以 耐除草剂大豆 DAS-68416-4 质量分 数为 0.1%1.0%的 基因组 DNA（或采用 大豆 DAS-68416-4 与非转基因 大豆 基因组相比的拷贝数分数为 0.1%1.0%的DNA 溶液） 作为阳性对照；以水作为空白对照。 各对照 PCR 反应体系中，除模板外 ， 其余组分 及 PCR 反应条件 与 5.3.5.1 相同 。 6 结果分析与表述 6.1 Lectin内标准基因无
12、 典型扩增曲线，表明样品中未检出 大豆 成分，结果表述为 “ 样品中未检测出大豆 成分 ，检测结果为阴性” 。 6.2 Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且 Ct值 38；同时 DAS-68416-4转化体特异性序列 出现 典型扩增曲线 ， 且 Ct值 38，表明样品中检测出 DAS-68416-4转化体成分 ，结果表述为 “ 样品中检测出 转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4转化体成分 ，检测结果为阳性 ” 。 DB12/T 6522016 4 6.3 Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且 Ct值 38；但 DAS-68416-4转化体特异性序列 未 出现 典型扩增曲线 ，
13、 表 明样品中未检测出 DAS-68416-4转化体成分 ，结果表述为 “ 样品中未检测出 转基因耐除草剂 大豆 DAS-68416-4 转化体成分 ，检测结果为阴性 ” 。 6.4 Lectin 内标准基因 和 /或 DAS-68416-4 转化体特异性序列 出现 典型扩增曲线 ， 但 Ct 值在 38 40之间， 进行重复实验 。 如重复实验 结果符合 6.1 6.3 的情形，依照 6.1 6.3 进行判断。如 重复实验 检测参数 出现 典型扩增曲线 ， 但 检测 Ct 值 仍在 38 40 之间 ，则判定样品检出 Lectin 内标准基因和 /或 转化体特异性序列 ，根据检出参数 情况，
14、参照 6.1 6.3 对样品进行判定 。 DB12/T 6522016 5 附录 A （ 资料性附录 ） A.1 Lectin基因 实时荧光 PCR扩增产物核苷酸 序列 （ Accession No.K00821） 1 GCCCTCTACT CCACCCCCAT CCACATTTGG GACAAAGAAA CCGGTAGCGT TGCCAGCTTC 61 GCCGCTTCCT TCAACTTCAC CTTCTATGCC CCTGACACAA AAAGGCTTGC AGATGGGC 注：划线部分为 lec-1215F 和 lec-1332R 引物序列，方框内为探针 lec-1269P 序 列。 A.2 耐除草剂大豆 DAS-68416-4转化体特异性 序列 1 GGGCCTAACT TTTGGTGTGA TGATGCTGAC TGGTGCTTGA ATGATTTAAA AATAAATTTT 61 TAATTTAGTT GTAACAAGTT TTAAGTATTT TTTTATATTA ATTTATTGCA TTACGACAGA 121 AGCAAGTA 注 1： 划线部分为 DAS-68416-4-F 和 DAS-68416-4-R 引物序列 ， 方框内为探针 DAS-68416-4-P 序列 。 _
