1、ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 31112020 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 Detection method of real time quantitative RT-PCR for Feline calicivirus 2020 - 03 - 16 发布 2020 - 03 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 31112020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB /T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学、吉林
2、省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：胡桂学、王开、郭衍冰、姜雪、黄海龙、呼延含蓉、赵艳丽、程荣华、伊淑帅、 牛江婷。 DB22/T 31112020 1 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结 果判定和废弃物处理的技术要求。 本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试
3、验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct 循环阈值 （Cycle threshold） Cdna 互补脱氧核糖核酸 （Complementar y Deoxyribonucleic acid） DMEM 改良Eagle培养基 （Dulbeccos modification of Eagles medium） ORF 开放阅读框 （Open Reading Frame） RNA 核糖核酸 （Ribonucleic acid） RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 （Reverse transc
4、 ription polymerase chain reaction） 4 原理 根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探针。探针在5端标记FAM荧光素作 为报告荧光基团，3端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的 基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；反应 进入延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核 酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来， 所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式 增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与
5、该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，Ct值越小。 5 试剂和材料 5.1 试剂 DB22/T 31112020 2 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.1.1 DMEM 培养液。 5.1.2 液氮。 5.1.3 RNA 提取试剂盒。 5.1.4 反转录试剂盒。 5.1.5 阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录 RNA。 5.1.6 阴性对照，为不含猫杯状病毒的细胞培养液。 5.1.7 无 RNA 酶的水（Rnase free water）。 5.1.8 Taq 酶。 5.2 材料 5.2.1 无菌
6、拭子。 5.2.2 离心管，1.5 mL、15 mL 和 50 mL。 5.2.3 吸头，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L 和 0.5 L10 L。 5.2.4 无 RNA 酶吸头，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L 和 0.5 L10 L。 5.2.5 无 RNA 酶离心管，0.2 mL 和 1.5 mL。 5.2.6 研钵。 5.2.7 荧光定量 PCR 反应管, 根据荧光 PCR 仪要求选择单管、八连排管或 96 孔荧光反应板。 5.3 引物和探针 引物及探针使用时配制成表 1 中浓度，置-20 保存，6 个月内使用。 表1 引物序列
7、和浓度 引物和探针名称 序列 53 浓度 mol/L 上游引物 F CTGACTTCAAATTTCATCTC 0.20 下游引物 R TGGGAATTAAGTCAGAGG 0.20 探针 (FAM) ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC (Eclipse) 0.40 6 仪器设备 6.1 冰箱，-202 ，-802 。 6.2 高速冷冻离心机，12 000 r/min 以上。 6.3 可调移液器，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L 和 0.5 L10 L。 6.4 天平，感量 0.01 g。 6.5 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 。 6.6 荧光
8、定量 PCR 扩增仪。 7 样品 7.1 样品的采集 DB22/T 31112020 3 7.1.1 将无菌拭子（5.2.1）在口腔和鼻腔内，刮取分泌物，将拭子插入离心管（5.2.2）中，加盖并 标记，冷藏送检。 7.1.2 组织样品主要采集气管和肺脏，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，做好标记，冷藏送检。 7.2 样品的处理 7.2.1 口鼻拭子的处理 拭子样品用 600 L DMEM（5.1.1）浸润后，3 000 r /min 离心（6.2）15 min，取上清液 500 L （6.3、5.2.4）于 1.5 mL 无 RNA 酶离心管（5.2.5）中。 7.2.2 组织处理 采取不少于
9、500 mg（6.4）的组织样品，在研钵（5.2.6 ）内加液氮（5.1.2）研磨，收集于 1.5 mL 无 RNA 酶的离心管（5.2.2）中。 8 试验步骤 8.1 模板的制备 8.1.1 使用 RNA 提取试剂盒（5.1.3）提取样品 RNA，操作方法按说明书进行。 8.1.2 采用反转录试剂盒（5.1.4、6.5）制备待检样品的 cDNA 作为模板，操作方法按说明书进行。 8.1.3 阳性对照（5.1.5）、阴性对照（5.1.6）均按照待检样品操作方法进行。 8.2 反应体系 在荧光定量PCR反应管（5.2.7）中依次加入表 2 所示的试剂后，盖紧管盖，震荡混匀，瞬时离心。 表2 反应
10、体系 试剂 剂量 Rnase free water 8.5 L 模板 2.0 L 上游引物 F 0.5 L 下游引物 R 0.5 L 探针 1.0 L Taq酶 12.5 L 总体积 25.0 L 8.3 反应程序 将荧光定量 PCR 反应管放入荧光定量 PCR 扩增仪（6.6）内，记录样品摆放顺序。循环参数设置见 表 3 。在第二步 55 退火 10 s 处设置收集荧光信号。 DB22/T 31112020 4 表3 反应程序 反应步骤 温度 时间 s 循环数次 第一步 95 30 1 95 5 55 10 第二步 72 20 40 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值
11、设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器 可根据仪器型号进行调整。 9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照无 Ct 值，并且无扩增曲线。 9.2.2 阳性对照的 Ct 值应35，并出现特定的扩增曲线。 9.2.3 如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，试验视为无效。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性判定 无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无猫杯状病毒核酸，判为阴性。 9.3.2 阳性判定 9.3.2.1 Ct 值35，出现特定的扩增曲线，表示样品中存在猫杯状病毒核酸，判为阳性。 9.3.2.2 35Ct40，应进行重复试验。如果重复试验的 Ct 值40，且曲线有明显的对数增长期， 判为阳性。 10 废弃物处理 10.1 检测的样品及接触物，应收集后高压灭菌处理，防止污染措施应符合 GB/T 27401 的规定。 10.2 检测过程中的废弃物及个人防护，应符合 GB 19489 的规定。 _
