1、DB43/T 8602014湖南省地方标准DB43湖南省质量技术监督局 发 布2014-03-01 实施2014-02-13 发布ICS 67.060B 21SSR分子标记法杂交水稻种子真实性和纯度鉴定hybrid rice seeds by using SSR markersIdentification of genuineness and purity ofDB43/T 8602014 I 目 次 前言 1 范围 12 规范性引用文件 13 术语和定义 14 原理 25 主要仪器设备 26 主要试剂 27 分析步骤 3附录 A（资料性附录） 试剂配制 5附录 B（资料性附录） PCR 反应
2、试剂配制 7附录 C（资料性附录） 推荐使用的 48 对 SSR 引物在水稻基因组分布及其序列 8参考文献 10DB43/T 8602014 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由湖南省水稻研究所提出，由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：湖南省水稻研究所、湖南省种子管理局。 本标准起草人：詹庆才、李稳香、朱克永、龚浩如、刘之熙、罗建军、熊伏星、陈祖武、陶曙华、陈英姿、曾曙珍。 DB43/T 8602014 1 杂交水稻种子真实性和纯度鉴定 SSR分子标记法 1 范围 本标准规定了杂交水稻种子真实性和纯度的SSR分子标记鉴定方法。 本标准适用
3、于杂交水稻种子及其植株真实性和纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB 4404.1 粮食作物种子 禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 种子的真实性 genuineness of seed 供试品种与国家长期库保存样本和数据库信息、新品种审定信息、新品种保护信息是否相符。 3.2 品种纯度 varietal p
4、urity 本品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的的百分率表示。 3.3 变异株 off-type 一个或多个性状（特征特性）与原品种育成者所描述的性状显著不同的植株。 3.4 SSR标记 simple sequence repeat，SSR 即简单重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，大多由15个核苷酸重复单位聚集而成的一般长达100200个碱基的串联重复序列。 3.5 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 一种在体外大量扩增目的基因或特定DNA片段的分子生物学技术，该技术以短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温
5、的DNA聚合酶，只需非常少量（通常在纳克级范围内）的DNA样品，在短时间内以样品DNA为模板合成上亿个拷贝。 DB43/T 8602014 2 4 原理 SSR真实性鉴定是利用分布在12条染色体上48对SSR引物，扩增标准样品与送检样品DNA，比对同一SSR位点处DNA序列扩增谱带的多态性，鉴定送检样品真实性。 SSR纯度鉴定是选用双亲互补型引物，利用SSR标记的共显性特征，对送检样品的DNA进行扩增，根据产生的父母本互补谱带的位置，鉴定送检样品的纯度。 5 主要仪器设备 5.1 PCR扩增仪 5.2 紫外凝胶成像系统 5.3 电泳仪：最高电压2000 V,最大功率100 W 5.4 水平电泳
6、槽及配套的灌胶附件 5.5 微量可调移液器：规格分别为10 L、200 L、1000 L连续可调 5.6 低温冰箱：最低温度20 5.7 高压灭菌锅：120 2 5.8 恒温水浴锅：温控精确度1 5.9 光照培养箱：控温范围1060 5.10 冷冻离心机：最大离心力20000 g 5.11 电子天平：分度值0.01 g 6 主要试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所有水符合GB/T 6682中规定的三级以上水的要求。相关试剂配制要求见附录A。 6.1 DNA提取试剂盒 6.2 DNA提取试剂盒 6.3 2xCTAB提取缓冲液 6.4 70%冷乙醇 6.5 95%冷乙醇 6.6 高盐缓
7、冲液 6.7 TE缓冲液 6.8 6x上样缓冲液 6.9 溴化乙锭溶液 6.10 Taq DNA聚合酶 DB43/T 8602014 3 6.11 dNTP 6.12 引物 6.13 氯仿：异戍醇（24：1） 6.14 异丙醇 6.15 TAE缓冲液 6.16 琼脂糖 7 分析步骤 7.1 样品DNA提取 7.1.1 用于真实性鉴定的样品DNA的提取 按GB/T 3543.4规定的方法，从送检样品及对照样品中随机各抽取至少200粒种子发芽。送检样品及对照样品的种子质量均应符合GB 4404.1中对水稻种子纯度的要求。选取100根混合苗（约0.5 g材料），用液氮研磨，加入0.5 mL 2xCT
8、AB提取缓冲液充分混匀后，加入0.5 mL CTAB缓冲液。在（5565）恒浴30 min。加入1 mL氯仿:异戊醇（24:1）， 充 分 摇动5 min，8000 g，室温下离心5 min。取上清液加入0.6x体积异丙醇，室温下30 min，5000 g，4 离心5 min。沉淀用0.8 mL 高盐缓冲液充分溶解，15000 g 离心2 min，上清加入0.6x体积异丙醇，室温下30 min，5000 g，4 离心5 min。沉淀用400 L双蒸水溶解，加入2.5x体积95%的冷乙醇，20 冰箱中2 h 以上，15000 g 离心20 min。用70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200 L
9、 0.1xTE缓冲液溶解。用时稀释100x，取1 L进行PCR反应，或置4 保存。 7.1.2 用于纯度鉴定的样品DNA的提取 按GB/T 3543.4规定的方法，从送检样品中抽取500粒种子发芽。分单株剪取（0.51）cm长的水稻幼苗，放入96孔PCR板的孔中，每孔1株幼苗样品。每孔加入40 L DNA提取试剂盒缓冲液，在沸水中30 s，然后加入60 L DNA提取试剂盒缓冲液，在沸水中煮沸2 min，取1 L进行PCR扩增，或置4 保存，保存不超过7 d。 7.2 PCR扩增 7.2.1 真实性鉴定引物筛选 真实性鉴定时先用24对引物（附录C推荐类型为）进行筛选，如未检测到差异，再用另外2
10、4对引物（附录C推荐类型为）进行筛选。推荐使用的48对基本核心引物及其序列参见附录C。 7.2.2 纯度鉴定引物筛选 用（2448）对多态性强的引物进行筛选，找出带型清晰的23对多态性引物。 7.2.3 标准PCR反应液的配制及扩增准备 在10 L的反应体积中进行。反应体积包含0.2 mol/L引物，0.1 mmol/L dNTP，0.6单位Taq DNA 聚合酶，1 L 10xPCR反应液（100 mmol/L Tris-HCl，pH8.3，15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KCl，DB43/T 8602014 4 0.01%的明胶），模板DNA为10 ng，相关PCR反
11、应试剂的配制参见附录B。 100管PCR反应试剂的配制：在1.5 mL的离心管中,加入100 L 10xPCR反应液(含Mg), 50 L dNTP(2 mmol/L), 12 L Taq DNA 聚合酶(5 U/L)，40 L引物(正向引物和反向引物各5 mol/L),加入双蒸水698 L，充分混合。取一高压灭菌的96孔PCR板，每孔中加入1 L DNA和9 L PCR反应试剂，相关PCR反应试剂的配制参见附录B。 真实性鉴定的扩增反应条件为：94 变性4 min，然后是94 30 s，55 30 s，72 1 min进行35个循环，最后72 延伸7 min。反应用96孔PCR盘在PCR扩增
12、仪上进行。 纯度鉴定的扩增反应条件为：94 变性4 min，然后是94 15 s，55 15 s，72 30 s进行35个循环，最后72 延伸5 min。反应用96孔PCR盘在PCR扩增仪上进行。 7.3 凝胶制备 称取4 g琼脂糖凝胶，加入96 mL 1xTAE缓冲液，室温下放置30 min，在微波炉中煮沸8 min，用沸水加至原来体积，待冷却至60 左右时，加入5 L溴化乙锭溶液，倒入已插好25孔制胶梳的1212的制胶盒中（每板约70 mL），冷却后，缓慢抽去梳子，用于点样。 7.4 电泳进样 PCR结束后的样品，每孔加入1.5 L 6x上样缓冲液，扩增产物在4的琼脂凝胶上，100 V稳压
13、电泳3050 min（根据电泳片段的大小确定）进行电泳分离，在紫外光下观察拍照。 7.5 结果统计分析 7.5.1 真实性鉴定结果分析 根据送检样品和对照样品在48对引物位点处电泳谱带的异同，判断送检样品的真实性。 a）差异位点数2，判定为不同品种 b）差异位点数=1，判定为近似品种 c）差异位点数=0，判定为相同或极近似品种 按公式（1）计算品种相似率： S（%）=(LTLD)LT100% (1) 式中： S品种相似率； LT检测位点数； LD差异位点数。 7.5.2 纯度鉴定结果统计 纯度鉴定一般每个样品采用2对引物，检测200粒种子，以每100粒作为一组，若两组之间变异株幼苗数的误差在4
14、株以上，则重复作100粒。 按公式（2）计算品种纯度： P（%）=（NTND）NT100% (2) 式中： P品种纯度； NT供试幼苗数； ND变异株幼苗数。DB43/T 8602014 5 附录A （资料性附录） 试剂配制 A.1 DNA提取试剂 称取1 g氢氧化钠溶于99 mL水中。 A.2 DNA提取试剂 取10 mL 12 mol/L的盐酸溶于470 mL水中即成0.25 mol/L盐酸。将0.25 mol/L盐酸与0.5 mol/L Tris (PH8.0)按2：1稀释。 A.3 1 mol/L Tris溶液 (PH8.0) 称取121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入80
15、0 mL 双蒸水中溶解，加入浓盐酸58.4 mL，加水定容至1000 mL。 A.4 0.5 mol/L EDTA溶液（PH8.0） 称取186.6 g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）, 加入700 mL双蒸水中溶解，加入20 g 氢氧化钠，加水定容至1000 mL。 A.5 2xCTAB提取缓冲液 2% CTAB（w/v）, 100 mmol/L Tris(pH8.0), 20 mmol/L EDTA (pH8.0), 1.4 mol/L氯化钠, 1% PVP Mr40,000。称取20 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，81.9 g氯化钠, 10 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），加
16、入 100 mL 1 mol/L Tris溶液 (PH8.0)和40 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000 mL。 A.6 高盐缓冲液 10 mmol/L Tris(pH8.0), 1 mmol/L EDTA (pH8.0), 1 mol/L氯化钠。称取58.5 g氯化钠,加入10 mL 1 mol/L Tris溶液 (PH8.0)和2 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000 mL。 A.7 0.1xTE缓冲液 1 mmol/L Tris(pH8.0), 0.1 mmol/L EDTA (pH8.0)。1 mL 1 mol/
17、L Tris溶液 (PH8.0)和0.2 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（PH8.0），加水定容至1000 mL。 A.8 50xTAE电极缓冲液 称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加入100 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（PH8.0）和 57.1 mL冰乙酸，加水定容至1000 mL。用时稀释50x。 A.9 6x上样缓冲液 0.25%的溴酚兰，40%（w/v）蔗糖。称取0.25 g溴酚兰和40 g蔗糖，用双蒸水定容至100 mL。 A.10 溴化乙锭溶液 DB43/T 8602014 6 称取50 mg溴化乙锭（EB）溶于100 mL双蒸水中，配成0.5 m
18、g/mL的1000x贮存液，按1:1000稀释配制凝胶和染色液，溶液要避光（溴化乙锭是一种诱变剂）。 DB43/T 8602014 7 附录B （资料性附录） PCR反应试剂配制 表B.1 PCR反应试剂 1管 25管 100管 10PCR 反应液 1 L (1) 25 L 100 L dNTP (2 mmol/L) 0.5 L (0.1 mmol/L) 12.5 L 50 L DNA聚合酶(5 U/L) 0.12 L (0.06 U/L) 3 L 12 L DNA 1 L (2-5 ng/L) 引物(5 mol/L) 0.4 L (0.2 mol/L) 10 L 40 L H2O 6.98
19、L 174.5 L 698.0 L 总计 10 L 250 L 1000 L DB43/T 8602014 8 附录C （资料性附录） 推荐使用的48对SSR引物在水稻基因组分布及其序列 表C.1 48对SSR引物在水稻基因组分布及其序列 引物名称 染色体 长短臂 推荐类型 正向序列(5-3) 反向序列(5-3) RM297 1 长 TCTTTGGAGGCGAGCTGAG CGAAGGGTACATCTGCTTAG RM212 1 长 CCACTTTCAGCTACTACCAG CACCCATTTGTCTCTCATTATG RM1 1 短 GCGAAAACACAATGCAAAAA GCGTTGGT
20、TGGACCTGAC RM1195 1 短 ATGGACCACAAACGACCTTC CGACTCCCTTGTTCTTCTGG RM208 2 长 TCTGCAAGCCTTGTCTGATG TAAGTCGATCATTGTGTGGACC RM110 2 短 TCGAAGCCATCCACCAACGAAG TCCGTACGCCGACGAGGTCGAG RM71 2 短 CTAGAGGCGAAAACGAGATG GGGTGGGCGAGGTAATAATG RM341 2 长 CAAGAAACCTCAATCCGAGC CTCCTCCCGATCCCAATC RM232 3 长 CCGGTATCCTTCGAT
21、ATTGC CCGACTTTTCCTCCTGACG RM7 3 短 TTCGCCATGAAGTCTCTCG CCTCCCATCATTTCGTTGTT RM85 3 长 CCAAAGATGAAACCTGGATTG GCACAAGGTGAGCAGTCC RM251 3 短 GAATGGCAATGGCGCTAG ATGCGGTTCAAGATTCGATC RM273 4 长 GAAGCCGTCGTGAAGTTACC GTTTCCTACCTGATCGCGAC RM317 4 长 CATACTTACCAGTTCACCGCC CTGGAGAGTGTCAGCTAGTTGA RM307 4 短 GTACTACC
22、GACCTACCGTTCAC CTGCTATGCATGAACTGCTC RM5414 4 短 ACCATGGTTCAAGAGTGAAA ACAGCTCAACCTGTTGAGTG RM274 5 长 CCTCGCTTATGAGAGCTTCG CTTCTCCATCACTCCCATGG RM267 5 短 TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG AGCAACAGCACAACTTGATG RM480 5 长 GCTCAAGCATTCTGCAGTTG GCGCTTCTGCTTATTGGAAG RM164 5 短 TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC GCAGCCCTAATGCTACAA
23、TTCTTC RM253 6 短 TCCTTCAAGAGTGCAAAACC GCATTGTCATGTCGAAGCC RM30 6 长 GGTTAGGCATCGTCACGG TCACCTCACCACACGACACG RM190 6 短 CTTTGTCTATCTCAAGACAC TTGCAGATGTTCTTCCTGATG RM3 6 长 ACACTGTAGCGGCCACTG CCTCCACTGCTCCACATCTT RM336 7 长 CTTACAGAGAAACGGCATCG GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG RM214 7 短 CTGATGATAGAAACCTCTTCTC AAGAACA
24、GCTGACTTCACAA RM18 7 长 TTCCCTCTCATGAGCTCCAT GAGTGCCTGGCGCTGTAC RM248 7 长 TCCTTGTGAAATCTGGTCCC GTAGCCTAGCATGGTGCATG RM310 8 短 CCAAAACATTTAAAATATCATG GCTTGTTGGTCATTACCATTC RM264 8 长 GTTGCGTCCTACTGCTACTTC GATCCGTGTCGATGATTAGC RM337 8 短 GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG CGATAGATAGCTAGATGTGGCC RM72 8 长 CCGGCGATAAAACA
25、ATGAG GCATCGGTCCTAACTAAGGG RM219 9 短 CGTCGGATGATGTAAAGCCT CATATCGGCATTCGCCTG DB43/T 8602014 9 表C.1 （续） 引物名称 染色体 长短臂 推荐类型 正向序列(5-3) 反向序列(5-3) RM278 9 长 GTAGTGAGCCTAACAATAATC TCAACTCAGCATCTCTGTCC RM201 9 长 CTCGTTTATTACCTACAGTACC CTACCTCCTTTCTAGACCGATA OSR28 9 长 AGCAGCTATAGCTTAGCTGG ACTGCACATGAGCAGAGAC
26、A RM304 10 长 TCAAACCGGCACATATAAGAC GATAGGGAGCTGAAGGAGATG RM271 10 长 TCAGATCTACAATTCCATCC TCGGTGAGACCTAGAGAGCC RM311 10 短 TGGTAGTATAGGTACTAAACAT TCCTATACACATACAAACATAC RM216 10 短 GCATGGCCGATGGTAAAG TGTATAAAACCACACGGCCA RM224 11 长 ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGG RM286 11 短 GGCTTCATCTTTGGCGAC
27、 CCGGATTCACGAGATAAACTC RM21 11 长 ACAGTATTCCGTAGGCACGG GCTCCATGAGGGTGGTAGAG RM202 11 短 CAGATTGGAGATGAAGTCCTCC CCAGCAAGCATGTCAATGTA RM17 12 长 TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC GGTGATCCTTTCCCATTTCA RM19 12 短 CAAAAACAGAGCAGATGAC CTCAAGATGGACGCCAAGA RM247 12 短 TAGTGCCGATCGATGTAACG CATATGGTTTTGACAAAGCG RM235 12 长 TC
28、CTTCAAGAGTGCAAAACC GCATTGTCATGTCGAAGCC DB43/T 8602014 10参 考 文 献 1 J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南(第三版)M. 北京:科学出版社,2002. 2 McCouch et al. Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.)J. DNA Res. 2002, 9 :199-207. 3 詹庆才.利用微卫星DNA标记进行杂交水稻种子纯度鉴定的研究J. 杂交水稻. 2002, 5: 46-50. 4 薛灿辉,朱克永,詹庆才等. 利用微卫星标记鉴定金优207杂种纯度技术研究J. 湖南农业科学. 2005, 5 :6-8. 5 刘之熙,陈祖武,詹庆才等. 利用SSR分子标记快速鉴定杂交水稻种子纯度技术体系的优化. 杂交水稻. 2008, 1: 60-63.
