1、湖南省地方标准DB43莲藕抗腐败病室内鉴定技术规程Technical regulation for indoor evaluation of lotus root resistance to rotDB43/T 12572017 ICS 65.020B 17湖南省质量技术监督局 发 布2017-04-17实施2017-02-17发布DB43/T 12572017 I 目 次 前言1 范围 12 术语和定义 13 接种体制备 24 抗性鉴定场所与鉴定材料 25 接种 36 病情调查 37 抗病性评价 48 鉴定材料的处理 49 鉴定记载表格 4附录A（资料性附录） 莲藕腐败病症状及病原菌 5DB
2、43/T 12572017 II 前 言 本标准依据GB/T 1.12009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省植物保护研究所提出。 本标准由湖南省农业标准化委员会归口。 本标准起草单位：湖南省植物保护研究所；湖南省蔬菜研究所；湖南省衡阳县农业技术推广中心。 本标准主要起草人：魏林、梁志怀、马艳青、文吉辉、张屹、任福生、肖剑峰。 DB43/T 12572017 1 莲藕抗腐败病室内鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）抗腐败病鉴定的术语和定义、接种体制备、鉴定场所与
3、材料、接种、病情调查及抗病性评价。 本标准适用于莲藕品种抗腐败病的室内苗期鉴定和抗性评价。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 莲藕 lotus root 属莲科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo）,包括以采食膨大根状茎为目的的藕莲 （lotus root），和以采食莲子为目的的籽莲 （seed lotus ） 2.2 莲藕腐败病 lotus root rot 由尖孢镰刀菌莲专化型Fusarium oxysporum Schl.f.sp. nelumbicola (Nis.& Wat.)Booth引起的莲藕病害。该病害主要为害莲藕地下茎和根部，使得病茎出现褐色
4、或紫黑色不规则病斑，须根坏死脱离，地上部叶片和叶柄枯萎。 2.3 菌株 strain 菌株又称品系,表示任何由一个独立分离的单细胞(即单个病原粒子)繁殖而成的纯种群体及其后代。 2.4 致病性 pathogenicity 病原物所具有的破坏寄主植物和引起病变的能力。 2.5 接种体 inoculum 用于接种以引起病害的病原物或病原物的一部分。 2.6 接种悬浮液 suspension 用于接种的含有定量接种体的液体。 2.7 病情级别 dissease rating scale 人为定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。 2.8 病情指数 disease index（DI） 通过对植株个体
5、发病程度（病情级别）数值的计算所获得的群体发病程度的数值化描述形式。 DB43/T 12572017 22.9 抗病性 disease resistance 植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传性状。 2.10 抗病性鉴定 evaluation of disease resistance 通过适宜技术方法鉴定植物对特定病害的抵抗水平。 2.11 抗性评价 evaluation of resistance levels 根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应程度和抵抗水平的描述。 3 接种体制备 3.1 病原物分离与保存 3.1.1 病原物菌株分离 取具有典型腐败病症状的藕节部位
6、，用常规病组织分离法分离腐败病病原物。分离物形态学鉴定参见附录A.当鉴定确认为尖孢镰刀菌莲专化型后，进行单胞分离纯化。再经致病性验证后，即可作为接种用病原菌菌株。 3.1.2 菌株保存 短期保存：将病原物接种于PDA斜面培养基上，在25条件下培养7d后，置于4条件下保存。 长期保存：采用石蜡油低温保存法，即在斜面菌种上加一层灭菌的优质液体石蜡油（高出斜面顶部1cm），然后置于室温下或冰箱中保存。 3.2 接种体繁殖 将保存于PDA斜面培养基中的腐败病菌株移植于PDA平板培养基上，在25条件下培养，待菌株菌丝长满培养皿后，在无菌条件下，接种于盛有PD培养液的三角瓶中（液体培养基的量以占三角瓶容量
7、的30%35%为宜），25下120r/min振荡培养7d，培养液经两层灭菌纱布过滤，再经4000r/min 离心10min，倒掉上清液后，加入灭菌蒸馏水调制成分生孢子浓度为1105个/mL的接种悬浮液。 PDA培养基的配置：马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂20g，蒸馏水1000mL,121高压灭菌20min. PD培养液的配置：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL,121高压灭菌20min. 4 抗性鉴定场所与鉴定材料 4.1 鉴定场所 鉴定场所应具备人工调节室内温度、湿度和光照的条件。 4.2 鉴定材料 4.2.1 感病对照和抗病对照的选择 选择当地主栽的、历年腐败病发生较为严
8、重的品种，作为感病对照；选择当地主栽的、历年腐败病发生较轻的品种，作为抗病对照。 DB43/T 12572017 3 4.2.2 鉴定材料的育苗 挑选含有完整新鲜顶芽的待鉴定莲藕品种、感病对照及抗病对照作为试验材料，用小刀将顶芽带节下1cm处削下，冲洗干净后用75%酒精棉球擦拭伤口处，无菌水冲洗23遍后，栽入灭菌育苗基质土中，于2026条件下生长，期间注意保持栽培钵中土壤的湿润。 5 接种 5.1 接种时期 待顶芽苗长至三叶，顶芽下节位不定根长出35条时，接种腐败病病原菌菌株。 5.2 接种方法 将每个顶芽苗所长的新生根在距根尖0.5cm处剪断，以造成根系的伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节
9、的含105个孢子/mL腐败病菌接种悬浮液中20 min30 min. 5.3 接种后的管理 将接种后的顶芽苗移栽盆钵中栽培，栽培土为灭菌的沙壤土。每个材料重复3次，每重复15株苗。接种室的温度保持在2426间，栽种钵内始终保持有1cm2cm的水层。 6 病情调查 6.1 病情级别划分 幼苗叶片病情级别见表1。 表1 莲藕抗腐败病室内鉴定病情级别的划分 病情级别 症状描述 0 植株叶片未见任何发病症状 1 叶片仅叶缘出现零星病斑，病斑面积不超过该叶片总面积的5% 2 病斑沿叶缘连片，并向叶片中心发展，病斑面积占该叶片总面积的5%20% 3 病斑面积占该叶片总面积的21%40% 4 病斑面积占该叶
10、片总面积的41%60% 5 病斑面积占该叶片总面积的61%80%； 6 病斑面积占该叶片总面积的81%100%，叶片褐腐死亡 6.2 调查时间 接种后1520d调查，并根据此期间感病的对照品种病级扩展到感病病级的时间作适当的调整。 6.3 调查方法和病情指数的计算 调查每一株苗所有展开的叶片，根据表1中症状描述调查、记载每份材料叶片的病情级别，并按式（1）计算病情指数DI。 DB43/T 12572017 4DI= （dili）/(L6)100式(1) 式中： di各病情级别的代表数值； li各病情级别对应的叶片数； L调查总叶片数。 7 抗病性评价 7.1 抗病性评价标准 依据被鉴定材料3次
11、重复的病情指数（DI）平均值，按表2划分标准确定其抗性水平。 表2 莲藕品种对腐败病抗性的评价标准 病情指数（DI） 抗性评价 DI =0 免疫Immune(I) 0DI10 高抗 Highly resistant (HR) 10DI20 抗病 Resistant (R) 40DI60 中抗 Moderately resistant (MR) 60DI80 感病 Susceptible (S) 80DI100 高感 Highly susceptible(HS) 7.2 鉴定有效性判别 当感病对照材料达到相应感病程度（DI60），抗病对照材料与实际抗性程度相符时，该批次鉴定视为有效。 8 鉴定材
12、料的处理 鉴定完成后，将所有鉴定材料集中深埋或烧毁，接种土壤进行高温灭菌。 9 鉴定记载表格 莲藕抗腐败病鉴定结果记载表格见表3. 表3 莲藕抗腐败病鉴定结果记载表 病情级别 编号 品种 名称 来源 重复 0 1 2 3 4 5 6 病情 指数 平均病指 抗性评价 1.播种日期： 2.接种日期： 3.接种病原菌分离物编号 4.调查日期： 鉴定技术负责人（签字）： DB43/T 12572017 5 附录A （资料性附录） 莲藕腐败病症状及病原菌 A.1 症状 该病主要为害莲藕地下茎和根部，并造成地上部叶片和叶柄枯萎。地下茎发病早期外表没有明显的症状，但将其横剖检视，在近中心处的导管部分色泽呈现
13、褐色或浅褐色，受害变色部分会渐次扩展蔓延及至新生的地下茎，在藕节上还可观察到蛛丝状菌丝体和粉红色粘质物，此为病原分生孢子团(见图A.1)。发病后期病茎上有褐色或紫黑色不规则病斑，重病茎腐烂或不腐烂，不腐烂的发病部位一般呈现出纵皱状。受害茎节部位着生的须根坏死，易脱落，病茎藕小(见图A.2)。病茎初生的叶片叶色淡绿，并从整个叶缘或叶缘一边开始发生清枯状坏死，似开水烫过，最后整个叶片枯萎反卷。继之，叶柄的维管束组织变褐也随之枯死，并在叶蒂的中心区顶端向下弯曲，最后整个叶片死亡(见图A.3)；发病严重时，全田一片枯黄（见图A.4）。子莲受害时，叶片、茎杆症状同藕莲(图A.5,6)，从病茎抽出的花蕾瘦
14、小、慢慢从花瓣尖缘干枯，最后整个花蕾枯死。 图A.1 莲藕腐败病受害茎横切面，示菌丝体 图A.2 莲藕腐败病受害茎表面，黑腐坏死 和粉红色黏物质（病菌分生孢子团） 图A.3 腐败病引起藕莲叶缘水浸状青枯，并向下卷曲 图A.4 藕莲腐败病发病后期全田症状 DB43/T 12572017 6图A 5,6 腐败病引起子莲叶片水浸状青枯症状 A.2 病原菌 莲藕腐败病病原菌主要为尖孢镰刀菌莲专化型，学名为（Fusarium oxysporum Schl.f.sp. nelumbicola (Nis.& Wat.)Booth），属半知菌亚门镰刀菌属。该病原菌在PDA上生长时，气生菌丝呈绒毛状，菌落平贴伸展或成束状，初为白色，以后培养基中渐渐出现淡黄等色素。有大小两种分生孢子，一般以三个隔膜的大型分生孢子的尺度作为鉴定的标准。大型分生孢子薄壁无色，镰刀形，略弯曲，两端稍尖，有不明显的足胞，1-5个隔膜，多数有2-3个，大小为40-503-4.5微米。小型分生孢子卵圆形至长椭圆形，无色，单胞，少数为双胞，大小为5-122-3.5微米。 图A7 腐败病病原菌菌丝体及分生孢子 图 A8 腐败病病原菌大小分生孢子
