1、ICS 65.020.30 B 44 备案号 :40366-2014 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1053.1 2013 实验用鱼 第 1部分：微生物学等级及监测 Laboratory fish Part 1： Microbiological standards and monitoring 2013 - 12 - 20发布 2014 - 04 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1053.12013 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 微生物学等级分类 . 1 5 检测项目 . 2 6 检测程序
2、 . 2 7 检测要求 . 3 8 检测方法 . 4 9 结果判定 . 6 DB11/T 1053.12013 II 前 言 DB11/T 1053的本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 DB11/T 1053实验用鱼分为六个部分： 第 1部分：微生物学等级及监测； 第 2部分：寄生虫学等级及监测； 第 3部分：遗传质量控制； 第 4部分：病理学诊断规范； 第 5部分：配合饲料技术要求； 第 6部分：环境条件。 本部分为 DB11/T 1053的第 1部分。 本部分由北京市科学技术委员会提出。 本部分由北京市科学技术委员会归口。 本部分由北京市科学技术委员会组织实施。 本部分
3、起草单 位： 国家人口 计 生委科学技术 研究所、中国 科学 院水 生生物 研究所、中国食品药品 检 定 研究院 。 本部分 主要起草 人： 李爱华、崔宗斌、孙德明、岳秉飞、王天奇 。 DB11/T 1053.12013 1 实验用鱼 第 1部分：微生物学等级及监测 1 范围 DB11/T 1053的本部分规定了 实验用鱼 （斑马 鱼和 剑尾 鱼） 微生物学等级及监测 ，包括普通 级(CV) 和 无特定病原体级(SPF) 实验用鱼的微生物等级分类 、检测要求、检测程序、 检测方案、检测方法、结 果判定和 报告 等。 本部分 适于 实验用鱼 （斑马 鱼和 剑尾 鱼） 的微生物学等级 划分和质量监
4、测。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用 是必不可少 的。 凡是注日期的引用文件 ，仅所注日期的 版本 适用 于 本文 件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（包括所有的 修改 单）适 用于 本文件。 GB/T 4789.7 食品卫 生微生物学检验 副溶血 性弧菌 检验 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB/T 14926.15 实验 动物 肺炎链球菌 检测方法 GB/T 14926.16 实验 动物 乙型溶血 性链球菌 检测方法 GB/T 18652 致病性 嗜水气 单 胞菌 检验方法 SC/T 7201.2 鱼类 细菌 病检疫
5、技术规程 第2 部分： 柱状嗜纤 维菌 烂鳃 病诊断方法 SC/T 7201.3 鱼类 细菌 病检疫 技术规程 第3 部分： 嗜水气 单胞菌 及豚鼠 气 单胞菌 肠炎 病诊断方法 SC/T 7201.4 鱼类 细菌 病检疫 技术规程 第4 部分： 荧光假 单胞菌 赤皮 病诊断方法 SN/T 1869 食品中 多种 致病细菌 快速 检测方法 PCR法 SN/T 2439 鱼 鳃霉 病检 疫技术规范 斑马鱼 疾病 健康手册 2012年4月 24日国 际 斑马 鱼资源中心 (ZIRC Health Services Zebrafish Disease Manual,M.L. Kent, J.M. S
6、pitsbergen, J.M. Matthews, J.W. Fournie, K.N. Murray and M. Westerfield) 3 术语和定义 下列术语和定义 适用 于本文件。 3.1 实验用鱼 laboratory fish 经 人工 饲养 、繁育 ，对其携带 的病 原微生物及寄生虫实 行控制 ，遗传 背景 明 确或者来源清楚 ，用 于科学 研究、 教学 、生 产、 检定 以及 其他 科学实验的鱼类。 4 微生物学等级分类 DB11/T 1053.12013 2 4.1 普通级实验用鱼 conventional(CV) laboratory fish 不携带 所规定的鱼的
7、烈性传 染 病病 原和 与人 共患 病的病原 。 4.2 无特定病原体级实验用鱼 specific pathogen free(SPF) laboratory fish 除 了普通 级应 排除 的病 原体 外 ，不 携带 所规定的 对实验用鱼 危害大 、 重 要潜在感染或 条件 致病和对 科学实验 干扰大 的病 原体 。 5 检测项目 5.1 外观检查 外观健康 、无 异常 。 5.2 微生物学检测项目 普通级(CV) 和 无特 定病 原体 级 (SPF)实验用鱼病 原微生物检测项目 见表 1。 表 1 CV和 SPF实验用鱼病原微生物检测项目 等级 应排除的病原微生物 检测要求 无 特 定
8、病 原 体 级 普 通 级 海分枝杆菌Mycobacterium marinum 龟 分 枝杆菌Mycobacterium chelonae 脓肿分枝杆菌Mycobacterium abscessus 嗜血分枝杆菌Mycobacterium haemophilum 霍乱弧菌 Vibrio cholerae 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 海豚链球菌 Streptococcus iniae 柱状黄杆菌Flavobacterium colummare 维隆尼气单胞菌Aeromonas veronii 简氏气单胞菌Aeromonas jandaei 偶发分枝杆菌Mycobact
9、erium fortuitum 水 霉 菌 Saprolegnia spp. 鳃霉菌Branchiomyces spp. 嗜 鳃黄杆菌Flavobacterium branchiophilum 嗜 冷黄杆菌Flavobacterium psychrophilum 荧光假单胞菌Pseudomonas spp. 温 和 气 单 胞菌Aeromonas sobri 链球菌 Streptococcus spp* 注 1： 必 须 检测项目：指在进行实验用鱼质量评价时必须检测的项目。 必要时检测项目：指引进实验用鱼时或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。 注 2：* 指海豚链球菌之外的链球菌 6 检测程
10、序 检测程序 见图 1。 DB11/T 1053.12013 3 抽样 编号 外观检 查 麻醉 1 ) 体表微生物学检 查和 取材 剖检及 体内 微生物学检 查和 取材 解剖镜 和显 微镜 检查 微生物学分 离培 养鉴 定 -必 要 时 取 水 样 检测结果 检测报告 图 1 微生物学检测程序 7 检测要求 7.1 检测频率 每 3个月 至少 检测 1次。 7.2 样品要求 7.2.1 样 品应 为 3月龄 以上成 鱼，必要 时同 时取 饲养 环境 水样作 为样 品。 7.2.2 应 在 不同 的水 环境 内随机抽样。 7.2.3 抽样采集样 品数 量， 见表 2。 表 2 抽样采集样品数量
11、同一水环境实验用鱼数量 抽样数量 100尾 以 下 5尾 100尾 以 上 5%，最大取样量为30 尾 7.2.4 采集的 样品应新 鲜， 避免冰冻， 避免 人为 污染 和采样误差 。每一样 品要 附有 编号和 标志并附送 检单， 写明 样品 的来源 、品 种 品系 、级 别、 数量 、检测项目和 采样 时间 。 7.2.5 样 品 采集 ：按照 细菌、 真菌 的 取样 要求 ，与 寄生虫学 、 病理学 或遗传学等检测 联 合取样 。 1) 活 体 实验用鱼的麻醉，应方便于检查、采样和满足动物福利伦理的要求。 DB11/T 1053.12013 4 7.2.6 取样顺 序： 先做 细菌、 真菌
12、 接 种， 然后取样 用于 PCR检测 ，最 后进行 固定 ，用 于 组织学检 查。 7.3 检测内容 7.3.1 外观检 查：检 查体 表、 鳃部和天 然孔 。 7.3.2 剖 检检 查：检 查胸腔 、腹腔内各器官 。 7.3.3 解剖镜 和显 微镜 检查 ：通 过外部 、剖 检检 查取样 ，利 用组织 印迹 或组织 涂片 ，采用 适当 方法 染 色后， 观察 是否 有真 菌、细菌等 感染 的存 在。 8 检测方法 8.1 细菌和真菌的检测方法 细菌和 真菌 的检测方法 见表 3。 表 3 细菌和真菌的检测方法 微生物 检测方法 海分枝杆菌 抗酸染色（ZIRC ） 2) 龟 分 枝杆菌 抗酸
13、染色（ZIRC ） 脓肿分枝杆菌 抗酸染色（ZIRC ） 霍乱弧菌 微生物分离培养（GB/T 4789.7 ） 海豚链球菌 微生物分离培养（GB/T 14926.15） 链球菌 微生物分离培养（GB/T 14926.15及 GB/T 14926.16） 嗜水气单胞菌 微生物分离培养（SC/T 7201.3 ） 柱状黄杆菌 微生物分离培养（SC/T 7201.2 ） 嗜 鳃黄杆菌 微生物分离培养（SC/T 7201.2 ） 嗜 冷黄杆菌 微生物分离培养（SC/T 7201.2 ） 荧光假单胞菌 微生物分离培养（SC/T 7201.4 ） 维隆尼气单胞菌 微生物分离培养（GB/T 18652） 简
14、氏气单胞菌 微生物分离培养（GB/T 18652） 偶发分枝杆菌 抗酸染色（ZIRC ） （ 2）嗜血分枝杆菌 抗酸染色（ZIRC ） （ 2）水 霉 菌 微生物分离培养（GB 4789.15） 鳃霉菌 微生物分离培养（SN/T 2439） 温 和 气 单 胞菌 微生物分离培养（GB/T 18652） 8.2 分枝杆菌的区分鉴定方法 4种分 枝杆 菌的 区分 鉴定方法 见表 4。 2) 斑马鱼疾病健康手册2012 年 4月 24日国际斑马鱼资源中 心 (ZIRC Health Services Zebrafish Disease Manual,M.L. Kent, J.M. Spitsberg
15、en, J.M. Matthews, J.W. Fournie, K.N. Murray and M. Westerfield) DB11/T 1053.12013 5 表 4 4种分枝杆菌的区别鉴定方法* 色素 产生 硝 酸 还 原 Tween-80水 解 50g/LNaCl生 长 耐热触酶 （ 68 20min） 芳香硫 酸酯酶 尿素 酶 铁吸 收 生 长 速 度 偶发分 枝杆菌 - + + + + + + 速 生 龟 分 枝 杆 菌 - - - - + + + - 速 生 脓肿分 枝杆菌 - - - + + + + - 速 生 海 分 枝 杆 菌 光 照 后 可 产 生 色素 - + -
16、 缓 生 注 1： +： 84%以 上 菌 株阳性；- ：少于 16%阳 性；： 50% 84%阳 性。 注 2：* 嗜血分枝杆菌采用种特异性引物进行PCR快速检测。 8.3 PCR检测方法 按照SN/T 1869 进行 细菌 DNA提 取 、 PCR扩增 、电泳 和结果分 析。本部分 中有 关细菌 的属 或种 特 异 性PCR 扩增 引物 见表5 。对 扩增产 物进行常 规的分 子克 隆 和测序 比对 。 表5 特异性 PCR扩增引物序 列和 产 物大小 菌种或菌株 引物名称和序列 扩增产物大小 Flavobacterium spp. * AGRGTTTGATCMTGGCTCAG GGACC
17、CTTTAAACCCAAG 561bp Flavobacterium Colummare GCCCAGAGAAATTTGGAT TGCGATTACTAGCGAATCC 1193bp Flavobacterium psychrophilum AGAGTTTGATCATGGCTCAG GGTTACCTTGTTACGACTT 1498bp F. psychrophilum 巢式PCR引物 GTTGGCATCAACACACT CGATCCTACTTGCGTAG 1089bp Mycobacterium spp.*GCGAACGGGTGAGTAACACG TGCACACAGGCCACAAGGGA。 92
18、4bp Mycobacterium 巢式PCR引物 AATGGGCGCAAGCCTGATG ACCGCTACACCAGGAAT 300bp Mycobacterium haemophilum GACGAAGTCGTAACAAGG TGAACACGCCACCATTAC 220bp Vibrio spp.*AAATCAGGCTCGGGCCCT GCAATTTT(A/G)TC(A/G/T)AC(C/ T)GG 241bp Vibrio cholerae CACCAAGAAGGTGACTTTATTGT GAACTTATAACCACCCGCG 588bp DB11/T 1053.12013 6 表 5
19、特异性 PCR扩增引物序 列 和产 物大小（续） 菌 种或菌株 引物名称和序列 扩增产物大小 Streptococcus spp.*GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC ACGTTCGATTTCATCACGTTG 197bp Streptococcus iniae AAGGGGAAATCGCAAGTGCC ATATCTGATTGGGCCGTCTAA 850bp Aeromonas spp.*CTACTTTTGCCGGCGAGCGG TGATTCCCGAAGGCACTCCC 953bp 注： * 为相应细菌的属特异性引物。 9 结果判 定 9.1 合格判 定 所有检测 样品 的微生物学 指标都符 合该 等级 标准 要求 ， 则判定 该水 环境 内的鱼群 为 符合 该等级微生 物学标 准。 9.2 不合格判 定 在 检测的 样品中， 如有 一个 样 品的微生物学 指标 不符 合 该等级 标准 要求 ， 则判定该 水环境 内的鱼群 为 不 符合 该等级微生物学 标准。 _
