1、ICS 65.150 B 50 备案号 :54176-2017 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1397 2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 The technical protocol of screening oral antibacterials for fish 2017 - 03 - 22发布 2017 - 07 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1397 2017 I 前 言 本标准根据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标
2、准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产技术推广站。 本标准主要起草人：王小亮、王静波、王姝、曹欢、张文、王澎、徐立蒲、那立海。 DB11/T 1397 2017 1 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 1 范围 本标准规定了鱼类口服抗菌药物选 用原 则、 程序和操作流程 。 本标准 适用于养殖 鱼类 细菌 感染判断和治疗时 口服抗菌药物选 用。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用是必 不可 少的。 凡是 注日期的 引用 文件 ，仅所 注日期的 版本 适用于本文 件。凡是 不注 日期 的引用 文件，其最新版 本（包括所有的 修改 单）适用于 本文件。 GB/T 6682
3、 分析 实验室用 水规 格和试验方法 GB/T 27623.1 2011 渔用 抗菌药物药 效试验 技术规 范 第 1部分： 常量肉汤稀释法 药物 敏感性试验 SC/T 70142006 水生动 物 检疫 实验 技术规 范 SC/T 7201.1 2006 鱼类 细 菌病检疫 技术规 程 第 1部分 ：通用 技术 3 药物选用原则和程序 3.1 原则 抗菌药物 使用应遵循以下原 则： 药物种 类应符合国家有关 标准， 药品应获得国家批 准文号； 选 择 GMP认证企 业生 产的抗菌药物 ； 使用的 优先顺序是 磺胺 类四环素 类氨基糖苷 类氟喹诺酮 类酰胺醇 类。 3.2 程序 鱼类口服抗菌药
4、物的选 用程序参见附录 A。 4 操作流程 4.1 病鱼采集 病 鱼 采集按 SC/T 7014 2006第6 章的规定 进行 。 4.2 病原菌的分离 病原菌的 分离参见附录 B。附录B 中的BHIA 的培 养基配方 参见 C.1。 4.3 细菌感染判断 任 何一个划线 分离平板， 线上有 菌落或 菌带， 则该样 品 来源 养殖 池塘 的鱼类 宜用口服抗菌药物； 反 之 ， 则不 必使用 。 DB11/T 1397 2017 2 4.4 敏感药物筛选 采取纸片扩散 法（ 参见 D.3） 筛 选敏感 药物 种类。 依检 测结果 选择敏感 药物 种类 ，原 则如 下： 一个样 品仅获得 一株 病
5、原 菌，选 择该 菌的 敏感 药物 种类； 一个样 品获得 多株 病原 菌， 选 择共同 的敏感 药物 种类 ； 一个样 品获得 多株 病原 菌， 且无共同 的敏感 药物 种类 ， 选择 内脏器官 分离 菌的 敏感 药物 种 类 ， 优先选 取肝 、肾 分离 菌的 敏感药物 种类。 4.5 用药剂量确定 4.5.1 检测病原菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration ，MIC ） 采用浓度梯度 稀释法（ 参见 D.4）检 测其对 样品所有病原菌的 MIC值。 4.5.2 计算样品每千克鱼的日用药剂量 按4.5.1 检测样 品所有病原菌的MIC 值， 同种
6、 药物选 取 最大的 MIC值。 每种敏感 药物 按公式 （1 ） 计算 样品每千克 鱼的 日用 药剂 量，每千克 鱼的 日用 药剂 量不超过 国家 兽药规定的 使用许 可值 。 r = S MIC U . (1) 式中： U 每千克 鱼的 日药物 使用 剂量（ 指有效 成分 剂量）， 单位 为毫克每千克 （ mg/kg）； MIC 抗菌药物 对病原 菌的MIC 值， 单位 为毫克每升 （ mg/L）； S 系数 ，鲤科 鱼类 为8.1 ，冷 水鱼类 为 9.4，养殖者 可依 经验 微调 该系 数； r 水的 密度 ，数 值约 为1， 单位 为千克每升 （ kg/L）。 4.5.3 计算样品池
7、塘的日药物总使用剂量 每 种敏感 药物 按公式 （2 ） 计算样 品池塘 的日 总用 药剂 量 。 1000 = T U M (2) 式中： M 样品 池塘 的日 药物 总使用 剂量（ 指有效 成分 剂量）， 单位 为克 （g ）； U 每千克 鱼的 日药物 使用剂 量（ 指有效 成分 剂量）， 单位 为毫克每千克 （mg/kg ）； T 样品 池塘 养殖 鱼类的 总重 量， 单位 为千克 （kg ） 。 4.6 使用方法 将 样 品鱼 来源池塘 的饵料 日投喂 量减少 一半 。将4.5.3确定的 日 药物 总使用剂 量溶解拌入饵料 中， 充 分 混匀 ，一 次性 投喂 使用 。 4.7 用药
8、效果评价 用 药 后， 按以下原 则判断用 药 效果 ： 如用药 后 3 d 5 d，日 死亡数量 明显 下降 或疾 病的 症状改 善甚至消失 ，则 认定药物 治疗有效； 如用药 后 3 d 5 d， 鱼的 日死亡数 量保持 治疗 前的水 平或 者超过 治疗 前的水 平，则 认定药物 治疗无 效。 DB11/T 1397 2017 3 A A 附 录 A （资料 性附录） 鱼类口服抗菌药物选用程序 图 A.1 鱼类口服抗菌药物选用程序 示意 是 否 发病池 敏感药物 筛选 用 药 剂量 确定 使用方法 病 鱼不 用抗菌药物 治 疗 及 用 药 效 果 评 价 平板线上 是否 有 菌 落或 菌带
9、 病鱼采集 病原菌的 分离 DB11/T 1397 2017 4 B B 附 录 B （资料 性附录） 病原菌的分离 B.1 设备和 材料 B.1.1 普 通 天平 ：0 g 210 g， 精确至 0.01 g。 B.1.2 高压灭 菌锅 。 B.1.3 微 波 炉。 B.1.4 生 物 安全柜 或超 净工 作台 。 B.1.5 生 物 显微镜 ： 10， 40 ，100 。 B.1.6 培 养 皿： 直径 90 mm。 B.1.7 酒精灯 、解剖盘 、解剖刀 、剪子 、镊子 、接 种环 （针 ） 、三角烧瓶 （500 mL ） 等。 B.1.8 试 剂 和培 养基 B.1.9 水：GB/T
10、6682 ，二级 。 B.1.10 脑心浸液琼脂 （Brain Heart Infusion Agar, BHIA ）：参见 C.1。 B.2 取样部位 病 灶 、肝 、肾 、脾 、性 腺、 脑 。 B.3 病原菌分离 B.3.1 冷水鱼病原菌分离 用 接 种环 从取样 部位 蘸取 病料， 无菌 操作 划线 接种于 BHIA平板 ， 22 2 培养 24 h 48 h， 无 菌 生 长 时 继续 培养 至5d。 B.3.2 温水鱼病原菌分离 用 接 种环 从 取样 部位 蘸 取病 料 ，无 菌 操作 划线 接 种于 BHIA平板， 28 2 培养24 h 48 h， 无 菌生长 时继续 培养
11、至5d。 DB11/T 1397 2017 5 C C 附 录 C （资料 性附录） 培养基 的配制 方法 C.1 脑心浸液琼脂 （BHIA ） C.1.1 成 分 牛 脑浸 粉 12.5 g 牛 心浸 粉 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢 二钠 2.5 g 琼脂 10 g 蒸馏水 1000 mL C.1.2 制 法 将 C.1.1 中 各成分 混匀， 加热溶解 ， 调pH至7.40.1 ， 121 高压灭菌 20 min， 冷至50 左右， 倾制平板 。 C.2 水解酪蛋白琼脂 （MHA ） C.2.1 成 分 牛 肉 浸膏 6.0 g 酸 水
12、 解酪蛋白胨 17.5 g 可 溶 性淀粉 1.5 g 琼脂 17.0 g 蒸馏水 1000 mL C.2.2 制 法 将 C.2.1中各 成分 混匀 ， 加热 溶解 ， 调pH 至 7.3 0.1， 121 高压灭 菌15 min， 冷至50 左右， 倾 制平板 。平板中 的培 养基 厚度4 mm。 C.3 水解酪蛋白肉汤 （MHB ） C.3.1 成 分 牛 肉 浸膏 6.0 g 酸 水 解酪蛋白胨 17.5 g 可 溶 性淀粉 1.5 g DB11/T 1397 2017 6 蒸馏水 1000 mL C.3.2 制 法 将 C.3.1中 各成 分 混匀 ，加热 溶解 ，调pH 至7.3
13、0.1 ，121 高压灭 菌 15 min。 如 检测 链球 菌， 临 用前加 无菌 血清 0.5%。 DB11/T 1397 2017 7 D D 附 录 D （资料 性附录） 病原菌的药物敏感性检测 D.1 设备和 材料 D.1.1 恒温培 养箱 ：0 60 。 D.1.2 精密天 平： 精确至 0.0001 g。 D.1.3 高压灭 菌锅 。 D.1.4 比浊仪 。 D.1.5 生 物 安全柜 或超 净工 作台 。 D.1.6 生 物 显微镜 ： 10， 40 ，100 。 D.1.7 微 量 移液 器： 100 L1000 L ，10 L 100 L。 D.1.8 多 通 道移 液器
14、：50 L 300 L 。 D.1.9 培 养 皿： 直径 90 mm。 D.1.10 试 管 、试 管架 ：15 mm 150 mm， 15 mm 100 mm。 D.1.11 微 孔 板（ 500 L/ 孔） 。 D.1.12 一 次 性针 头过 滤器 （ 0.22 m） 、注 射器 （5 mL） 。 D.2 试剂和 培养基 D.2.1 水：GB/T 6682 ，二级 。 D.2.2 0.45%氯化钠缓冲 液。 D.2.3 二 甲 基甲 酰胺 ：分析 纯。 D.2.4 氢氧化钠 ：分析 纯。 D.2.5 75%酒精 。 D.2.6 药 敏 纸片 。 -20 保存 ，药物 种 类及 其 溶解
15、 试剂见表 D.1。药 敏纸片 可从 可靠的 供应商 采购或 自 行制备 。 D.2.7 抗菌药物标准 品。抗菌药物 种 类参见 表D.1 ，标准 品 由兽药 管理 部门 指定单位提 供 。 D.2.8 水 解 酪蛋白 琼脂 （Mueller-Hinton Agar, MHA） ：参见 C.2。 D.2.9 水 解 酪蛋白 肉汤（ Mueller-Hinton Broth, MHB）： 参见 C.3。 D.3 纸片扩散 法 D.3.1 制 备菌 悬液 从培养 16 h 24 h的 BHIA斜面上 挑取 纯培 养菌 ，用 0.45%氯化钠缓冲 液配 制成 1.010 8 CFU/mL2.0 10
16、 8CFU/mL的菌 悬液 。 D.3.2 接种平板 制好的菌 悬液 应在 15 min内使用 。用 微量 移液 器取 100 L到MHA 平板上 ，灭 菌玻璃涂 布棒涂 匀。 DB11/T 1397 2017 8 D.3.3 贴 药敏 纸片 用灭菌的 镊子 取药 敏纸片 贴到D.3.2 接种 好的MHA平板上， 镊子 轻按 药敏 纸片 ，使 药 敏 纸片 与培 养 基 紧密相贴 。 每个培 养皿 均 匀贴四片 ， 标记 药物 名称、菌 株 名称和 培养时 间等。 于 28 2 (杀鲑气单 胞 菌 为22 2 )孵 育15 min 。 D.3.4 测抑菌 圈直径 将 D.3.3孵 育后 的平板
17、倒置于 28 2 (杀鲑气单 胞菌为22 2 )生化 培养箱 中，培 养24 h 2 h后， 观察 结果 。用 游 标卡尺 或直 尺测 量抑 菌圈 直径（ mm） 。 D.3.5 结 果 解释 按 照 表D.1 的标准 对抑 菌圈大 小 作出 解释，判断病原 菌对抗菌药物 敏感 或耐 药。 表 D.1 鱼类病原菌的抑菌 圈直径解释标准和 相对应 的最 低抑菌浓度 值（ MIC） 药物种类 药 名 配制母液的溶剂 药敏片含量 （g/片 ） MIC（ mg/L） 抑 菌 圈 直径（mm） 敏感 耐药 耐药 敏感 磺胺类药物 磺胺甲噁唑 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17
18、磺胺类药物 磺胺嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺类药物 磺胺二甲嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺类药物 磺胺间甲氧嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 13 17 四环素类 盐酸多西环素 蒸馏水 30 4 16 13 16 氨基糖苷类 硫酸新霉素 蒸馏水 10 4 16 12 16 酰胺醇类 氟苯尼考 0.1 mol/L二 甲 基 甲 酰胺 30 4 16 13 18 酰胺醇类 甲砜霉素 0.1 mol/L二 甲 基 甲 酰胺 30 4 16 12 16 氟喹诺酮类 恩诺沙星 2.5 mol/L
19、NaOH 5 2 8 12 16 D.4 浓度梯 度稀释 法 D.4.1 菌 悬液制 备 按 D.3.1制备 的菌 悬液 ，用灭 菌的 MHB稀释100倍 备用 。 D.4.2 抗菌药物的 配制 将不同 种类的抗菌药物用 相应溶 剂溶解后 （参见表 D.1），用 蒸馏 水稀释 、定容。磺胺 类药物 配成 10240 mg/L的原 液，其 它 药物配成 1280 mg/L。 用一 次性针 头过 滤器过 滤后 ， 4 冰箱 保存 ， 2 d内 使用。 D.4.3 抗菌药物药 液浓度 梯度的 建立 操作方法 按GB/T 27623.1 2011 中的 第5.2 条款执 行 。 D.4.4 菌 液接种 在 上 述制备 的药 液浓度梯度 的 试管 中， 每管加 0.1mL的 新 鲜配 制好 的待 测菌 悬液 ， 混匀 。 D.4.5 孵育 DB11/T 1397 2017 9 接 种 菌 悬 液后， 尽快置 于28 2 (杀鲑气 单 胞菌为 22 2 )下 培 养24 h 48 h， 每24 h 观察并 记录一 次结果 。 D.5 结果记 录 按GB/T 27623.1 2011中 的5.5 条款执 行。 _
