1、ICS 65.020.20 B 21 备案号：32102-2012 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 829 2011 白菜品种纯度及真实性分子检测方法 Methods of identifying varietal purity and genuineness of Chinese cabbage by using molecular markers 2011 - 11 - 10发布 2012 - 03 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 8292011 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义 . 1 4 原理 .
2、2 5 仪器设备及耗材 . 2 6 试剂和溶液配制 . 2 7 引物选用原则及筛选方法 . 3 8 操作步骤 . 4 9 检测结果 . 6 附录 A（规范性附录） 所用溶液的配置方法 8 附录 B（资料性附录） 白菜品种纯度检测常用的 SSR引物名称及序列 . 11 附录 C（资料性附录） 白菜真实性鉴定常用的 ISSR引物名称及序列 13 附录 D（规范性附录） 白菜基因组 DNA提取方法 . 15 附录 E（规范性附录） 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 . 17 附录 F（规范性附录） 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 . 19 DB11/T 8292011 II 前 言 本标准按照GB/
3、T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由北京市农业局 提出。 本标准由北京市农业 标准化技 术委员会归口。 本标准由北京市农业局 组 织 实施 。 本标准起草 单位：北京市种子管 理 站 。 标准主要起草 人：田雷、赵山普、贾希海、赵青春、彭瑞迪、王辉、福德平、高勇、张连平、黄寰。 DB11/T 8292011 1 白菜品种纯度及真实性分子检测方法 1 范围 本标准规定了结 球白菜和 不结球白菜种 子 品种纯度及真实性鉴定的SSR、ISSR分子 标 记 检测方法和 对检测结果的 判 定标准。 本标准适用 于结球白菜和不结 球白菜常规种子、杂交 种子及其亲 本的品种纯度和真实性鉴定。 2
4、规范性引用文件 下列文件对于 本文件的 应 用 是必不可少 的。 凡是注日期 的引用文件 ，仅 所 注日期的 版本适用 于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版 本（包括 所有 的 修改单 ）适用于 本文件。 GB/T 3543.4 农作物种 子 检 验规 程 发芽 试 验 GB/T 3543.5 农作物种 子 检 验规 程 真实性和品种纯度鉴定 3 术语与定义 下列术语和定义适用 于本文件。 3.1 SSR标记 simple sequence repeat marker，SSR 简单重复序列（ SSR） ,又称 短串联重复 序列或微卫星 序列， 它是一类以 1bp5bp的短 核苷酸序列
5、 为 基本单位串联重复状 分布于整个 基因组 内的重复 序列。 3.2 ISSR标记 inter simple sequence repeat marker， ISSR 内部简单重复 序列(ISSR)， 是 利用包含 重复序列 并在3 端或5端锚 定的单 寡聚核苷 酸引物对 基因 组进行扩增 的标记系统 ， 即 用 SSR引物来扩增重复 序列 之间的区域 。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction， PCR 一 种用于在体外扩增DNA序列的 技术程序。 模板 基因序列 先经高温 变性成为 单链， 在DNA聚合酶 的作 用和适宜的反应 条件下， 根据模板序列设
6、计的两条 引物 分 别 与 模板DNA两条链上相 应 的 一段互补序列 发 生退火而相互结 合，接着在 DNA聚合酶 的作用下 以四 种脱氧核糖核苷酸 （ dNTP）为底物， 使引物得以延 伸。然后不 断重复变性 、 退火 和延伸这一循环过 程， 使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。 3.4 引物 primer DB11/T 8292011 2 在DNA合成反 应时， 提供 3OH 末端作为 DNA合成 的起 点,能够与DNA 模板特 定区域特异 结 合 的多 核苷 酸单链。 4 原理 简单重复序列（ SSR）和内部 简单重复 序列(ISSR)广泛 分 布 于 白菜基因组的不 同位置上。 每个位
7、点 的重复单位或 序列会 因为品种的 不 同 而存 在 遗传 结构 上的差异， 这些差异表现为多态 性。 针 对重复单位 或 序列的不 同， 设计相 应 的 SSR引物和ISSR引物 ， 通过 PCR技术进行扩增、 电泳 、 染色 ， 形成白菜品种的 SSR和ISSR指纹图谱， 进行白菜品种纯度和真实性的鉴定。 5 仪器设备及耗材 5.1 仪器设备 5.1.1 天平(感量 0.0001g、 0.001g、 0.01g、0.1g）。 5.1.2 水浴锅(0 100）。 5.1.3 微波炉（额 定功率 800W）。 5.1.4 酸度计。 5.1.5 磁力搅拌器。 5.1.6 高速台式离心机（120
8、00r/min ）。 5.1.7 高压灭菌锅 。 5.1.8 冰箱（最低 温度-20 ）。 5.1.9 微量加样枪 （0.5 L10 L, 20 L200 L, 100 L1000 L）。 5.1.10 PCR扩增仪。 5.1.11 紫外成像仪。 5.1.12 紫外分光光 度计。 5.1.13 水平仪。 5.1.14 高压电泳仪（ 0V3000V、0mA 400mA、 额定功率 400W）。 5.1.15 电泳槽。 5.1.16 染色盒（55cm 38cm8cm）。 5.1.17 水平摇床。 5.1.18 胶片观察灯 。 5.1.19 数码照相机 。 5.2 耗材 离心 管 （0.2mL 、
9、0.5 mL、 1.5mL、 2.0mL） 、 枪头（ 10 L、 200 L、 1mL） 、 96孔 PCR板、一 次性 手 套、夹子、 吸水纸、 玻璃棒等 。 6 试剂和溶液配制 6.1 试剂 除另有规定 外，仅使 用分析纯试剂。 6.1.1 乙二胺四乙 酸二钠盐 （EDTA-Na 2）。 DB11/T 8292011 3 6.1.2 三羟甲基氨 基甲烷（Tris）。 6.1.3 盐酸（HCl）。 6.1.4 硼酸（H 3BO3）。 6.1.5 十二烷基硫 酸钠（SDS ）。 6.1.6 氯化钠（NaCl ）。 6.1.7 乙酸钠（NaAc ）。 6.1.8 Tris-饱和酚 。 6.1.
10、9 三氯甲烷。 6.1.10 异戊醇。 6.1.11 异丙醇。 6.1.12 无水乙醇。 6.1.13 四种脱氧核糖核苷酸 （dATP、dGTP、dCTP 、 dTTP）， 缩略为 dNTP。 6.1.14 Taq DNA聚合酶 。 6.1.15 10PCR 缓冲 液。 6.1.16 DNA标准分子 量标记 （Marker ）。 6.1.17 SSR引物。 6.1.18 ISSR引物。 6.1.19 丙烯酰胺。 6.1.20 N，N 亚 甲基双丙烯酰胺。 6.1.21 N，N，N ，N 四 甲 基 乙二 胺（TEMED）。 6.1.22 过硫酸铵(NH 4)2S2O8。 6.1.23 尿素。
11、6.1.24 亲水硅烷（bind-silane）。 6.1.25 疏水硅烷（repel-silane）。 6.1.26 甲酰胺。 6.1.27 溴酚蓝。 6.1.28 二甲苯青 FF。 6.1.29 冰乙酸（HAc ）。 6.1.30 硝酸银（AgNO 3）。 6.1.31 甲醛。 6.1.32 琼脂糖。 6.1.33 蔗糖。 6.1.34 溴化乙锭（EtBr）。 6.1.35 超纯水。 6.1.36 蒸馏水。 6.2 溶液配制 按照附录 A的规定配制溶液。 7 引物选用原则及筛选方法 7.1 引物选用原则 DB11/T 8292011 4 7.1.1 应优先选用 核心引物 库中的引物。当不
12、能满足需求 时，可以利用 已经公开 发表的引物 ， 也 可以 自 行 筛选引物。 7.1.2 当自行筛选 适宜品种纯度检测的 SSR引物 时 ，应 遵循扩增后的杂交 种 SSR电泳谱带 含有双亲 互 补带型，条 带清晰、重复性好 的原则。 7.1.3 当自行筛选 适宜真实性鉴定的 ISSR引物 时，应 遵循扩增后的 ISSR电泳谱 带多态性 高，条带清 晰 、重复性 好的原则。 7.2 引物筛选方法 7.2.1 自行筛选用 于品种纯度检测的 SSR引物 时， 选取 有代 表性的杂交 种种子 10粒及父母 本种子 各 5 粒。 利用一系 列 SSR引物进行 试验， 根据扩增后 的杂交 种电泳谱
13、带含有双 亲互补带型 ， 条 带清晰、重复 性 好 的原则 ，确定适 宜的引物。 7.2.2 自行筛选用 于真实性检测的 ISSR引物时 ，选取 有代 表性的常规种 子或杂交 种种子 5粒10 粒 及至少 10个以上不同 品种。 利 用一系 列 ISSR引物 进行 试 验， 根据扩增后 的常规种 或杂交种电泳谱带 多 态性高，条 带清晰、重复性好 的原则， 确定适宜 的引物。 7.3 核心引物库 7.3.1 白菜品种纯度检测常用的 SSR引物名称及序列参见 附录 B。 7.3.2 白菜真实性鉴定常用的 ISSR引物名称及序列参见 附录 C。 8 操作步骤 8.1 纯度检测 8.1.1 样品 D
14、NA的提取 使用种子直 接提取 DNA进行检测的样品 数量，按照 GB/T 3543.5的规定， 从送检样 品中随机 数取 100粒种子作 为试样 ；使用幼苗 提取 DNA进行检测的 样品数量， 按照 GB/T 3543.4的规定， 从净种子 中 随机数取一 定数量种 子（保证 100株幼苗 ）作为 试样 ，进行幼苗培养。 按照附录 D规定的方法提取样 品 DNA。 8.1.2 SSR-PCR扩增 8.1.2.1 SSR-PCR反应体系 SSR-PCR反应 的总体积 为20uL， 反应体系 见表1。 表1 SSR-PCR 反应体系 试剂 SSR-PCR终浓 度 SSR-PCR体积 超纯 水 1
15、0.7L 10PCR 缓冲 液 1 2L 25mmol/L氯 化镁 溶液 2.5mmol/L 2 L 2.5mmol/L dNTP混合 溶液 0.25mmol/L 2 L 10mol/L 上 、下 游引物溶液 0.5mol/L 1 L 5U/L Taq 酶 1.5U/管 0.3L DNA模板 10 ng/ L 50ng/L 2 L DB11/T 8292011 5 表 1 SSR-PCR反应体系（续） 试剂 SSR-PCR终浓 度 SSR-PCR体积 总体 积 20L 备 注 如 果 10PCR 缓冲 液中 含有 氯化 镁 ， 则 不加氯 化镁 溶 液 ，加等 体积超 纯水 。 8.1.2.2
16、 SSR-PCR反应 程序参数 SSR-PCR反应程 序 参 数见 表 2。 表 2 SSR-PCR反应 程序参数 程 序 SSR-PCR反应 温度 、时间 循环数 预 变性 95 ，5min 1个循环 降落 PCR 变性 ：94 ，45s 退火 ：60 51 ， 1min 延伸 ：72 ，1.5min 10个循环 ，退火温 度每 1 循环 下降 1 扩增 变性 ：94 ，45s 退火 ：50 ，45s 延伸 ：72 ，1min 35个循环 最 终延伸 72 ，7min 1个循环 保 存 4， 无限长 1个循环 注 ：使 用不 同的 PCR扩增 仪，应对 仪器 进行 调整 。 8.1.3 变性
17、聚丙烯酰胺凝胶电泳 按照附录E规定的方法 ，进行6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增 产 物。 8.2 真实性鉴定 8.2.1 样品 DNA的提取 使用种子直 接提取DNA 进行鉴定的 样 品 数量 ， 按照GB/T 3543.5的规定 ， 从送检样 品和标准 样品中各 随机数取10 粒种子作 为试样； 使用幼苗 提取DNA 进行 鉴定的样品 数量， 按照 GB/T 3543.4的规定 ， 从净 种 子和标准样 品中各随 机数取一 定数量种 子（保证 10株幼苗）作为 试样，进行 幼苗培养 。 按照附录D规定的方法提取样品 DNA。 8.2.2 ISSR-PCR扩增 8.2.2.1 ISSR-
18、PCR反应体系 ISSR-PCR反 应的总体 积为20uL ，反应体系 见 表 3。 DB11/T 8292011 6 表3 ISSR-PCR 反应体系 试剂 ISSR-PCR终浓 度 ISSR-PCR体 积 超纯 水 10.7L 10PCR 缓冲 液 1 2L 25mmol/L氯 化镁 溶液 2.5mmol/L 2 L 2.5mmol/L dNTP混合 溶液 0.25mmol/L 2 L 10mol/L 引物溶液 0.5mol/L 1 L 5U/L Taq 酶 1.5U/管 0.3L DNA模板 10 ng/ L 50ng/L 2 L 总 体积 20L 备 注 如 果 10PCR 缓冲 液中
19、 含有 氯化 镁， 则 不加氯 化镁 溶液 ， 加等 体 积超 纯水 。 8.2.2.2 ISSR-PCR反应 程序参数 ISSR-PCR反 应程序参 数见表4。 表4 ISSR-PCR 反应 程序参数 程 序 ISSR-PCR反 应温度、 时间 循环数 预变性 95， 5min 1个循环 降落 PCR 变性 ：94 ，1min 退火 ：63 54 ， 1min 延伸 ： 72， 1.5 min 10个循环 ，退火温 度 每 1 循环 下降 1 扩增 变性 ：94 ，1min 退火 ：53 ，1min 延伸 ： 72， 1.5min 35个循环 最 终延伸 72 ，7 min 1个循环 保存
20、4， 无限长 1个循环 注： 使用 不同 的PCR 仪，应对 仪器 进行 调整 。 8.2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 按照附录F规定的方法 ，进行5% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 扩增产物。 9 检测结果 9.1 纯度计算 鉴定SSR电泳谱 带带型的一 致性，计数供检样品种 子粒 数 （ 株 数 ）和非本品种种 子 粒 数 （株 数 ） ， 并 按 下 列 公式 计 算 电泳测定值 （品种纯度）： = 供检种子粒数 （株数） 数） 非本品种种子 粒数（株 供检种子粒数（株数） ） 品种纯度（ - % 100 . (1) DB11/T 8292011 7 9.2 真实性判定 9.2.1 对
21、供检样品与标准样 品的 20个 ISSR引物 位 点 的 DNA指纹谱带数据进行比较 ： 引物位点差异 2，判 定两个品种 为 不 同品种； 引物位点差异 1，判 定两个品种 为相近 品种； 引物位点差异 0，判 定两个品种 为 疑 同品种。 9.2.2 对相近品种和 疑 同 品种 ， 利 用供 检 样 品与标准样 品的 40个 引物位点 的 DNA指纹谱带 数据进行 比 较： 引物位点差异 2，判 定两个品种 为 不 同品种； 引物位点差异 1，判 定两个品种 为 近似 品种； 引物位点差异 0，判 定两个品种 为相同 品种或 极近似 品种。 DB11/T 8292011 8 A A 附 录
22、 A （规范性附录） 所用溶液的配 置 方法 A.1 DNA提取溶液的配制 A.1.1 1mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 称取三羟甲 基氨基甲烷 （ Tris） 121.1g 溶于800ml蒸馏 水 中 ， 用 HCl调节pH 值至8.0 后， 加蒸馏 水 定 容 至 1000ml，高压灭菌 。 A.1.2 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 称取乙二胺四乙酸二钠盐 （EDTANa 22H 2O）186.1g溶于800ml蒸馏水中,用NaOH调节pH值至8.0 （约 需NaOH颗粒20g），加 蒸馏水定 容至1000ml，高 压灭菌 。 A.1.3 20十二烷基硫酸钠
23、 （SDS） 称取十二烷 基硫酸钠 （SDS）20g 缓慢加入到 60ml蒸馏 水 中 ， 边加 热边搅拌 ， 完全 溶解后加 蒸馏水 定容至 100ml。 A.1.4 1%SDS-DNA提取液 称取氯化钠（NaCl）58.44g 溶 于 700mL蒸馏水中 ，加 入20十二烷基 硫酸钠（SDS ）50mL ，1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)100mL，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20mL，加蒸馏 水定容至1L ，分装 后高压灭菌 。 A.1.5 饱和酚:氯仿 :异戊醇混 合液(25:24:1) 25份饱和酚:24份氯仿 :1份异戊醇 （ v/v） A.1.6 70
24、乙醇溶液 30份水: 70份 无水乙醇 （v/v） A.1.7 TE缓冲 液（pH8.0） 取 1mol/L Tris-HCl（ pH8.0） 10 mL和 0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶液 2mL， 加 蒸馏水定 容至 1000 mL， 高压灭菌。 A.1.8 3mol/L乙酸钠 溶液 称取乙酸钠（NaAc）40.8g 溶于80ml 蒸馏水中， 用冰乙 酸 调 节 pH值至 5.2，加蒸馏 水 定 容到 100ml， 高压灭菌。 A.2 PCR扩增试剂配制 A.2.1 dNTP溶液 DB11/T 8292011 9 用超纯水分 别配制ATP 、 GTP、 CTP、 TTP终浓度为
25、 100mmol/L的储存 液， 各取20 L混 合， 加 入 720 L 超 纯 水 定 容至终浓度2.5mmol/L 的工作液（ 也 可直 接购买2.5mmol/L的dNTP 商品溶液） ， -20保存。 A.2.2 10 mol/L引物溶液 用超纯水或 TE缓冲 液分别 配制上、下 游 引物至终浓度 为 20mol/L 的储存 液， 等体 积混合成 10 mol/L 引物溶液。 A.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 溶液配制 A.3.1 6倍变性加样 缓冲液 量取甲酰胺49mL， 加 入0.5mol/L EDTA （ pH 8.0） 1mL， 溴酚兰0.125g ， 二甲 苯青FF 0.125 g
26、， 混匀。 A.3.2 6倍非变性加 样缓冲液 称取蔗糖40g 溶于99ml 去离子水 中， 加入 0.5mol/L EDTA（pH 8.0 ） 1mL， 溴酚 兰 0.125g， 二甲 苯青F F 0.125 g， 混匀。 A.3.3 10 TBE缓冲 液 称取三羟甲基 氨基甲烷 （Tris）108g ，硼 酸 55g， 加适量去离子 水溶解后 ，再加入0.5 mol/L ED TA（pH 8.0 ）37mL， 去离子水 定容至1000mL。 A.3.4 6%变性聚丙烯酰胺凝胶 溶液 称取 57g丙烯酰胺， 3g N， N -亚 甲 基 双 丙烯酰胺， 420.42g尿素， 倒入 1000m
27、L烧杯中， 加入 700mL 去 离 子 水 溶解 后 ， 加入 100mL 10TBE 溶液，加 去离 子水定容至 1000mL， 混匀，过 滤。 A.3.5 5%非变性聚 丙烯酰胺凝胶溶液 称取 48.14 g丙烯酰胺 ， 1.66 g N，N -亚甲基双 丙烯酰胺，倒入 1000mL烧杯 中 ， 加入 700mL去离 子水溶解后 ，加入 100mL 10 TBE溶液 ，加去离 子水 定容至 1000mL， 混 匀， 过 滤 。 A.3.6 亲和硅烷（bind-silane）缓冲 液 量取无水乙 醇49.75mL 和冰乙酸 250 L，混 匀。 A.3.7 0.5%亲和硅烷 （ bind-
28、silane） 在9.95mL亲 和硅烷缓冲 液 中 加入 50 L亲和 硅烷原液 ， 混匀。 A.3.8 25过硫酸铵 称取0.25g过 硫酸铵， 加1mL去 离子水溶 解，现用 现配。 A.3.9 1 TBE缓冲 液 量取10TBE 500mL ，加4500mL去离子 水，混 匀。 A.4 银染试剂配制 DB11/T 8292011 10 A.4.1 固定液 量取冰乙酸100mL，加 去离子水 定容至1000mL。 A.4.2 染色液 称取硝酸银2g ， 加 去离 子 水 定容 至 1000mL。 A.4.3 显影液 称取氢氧化 钠30g,量 取甲醛5mL ，加去离 子水定 容至1000m
29、L。 DB11/T 8292011 11 附 录 B （ 资料性附录） 白菜品种纯度检测常 用的 SSR引物名称 及序列 表B.1给出 了 白菜品种纯度检测常用的 SSR引物名称及序列。 表 B.1 白菜品种纯度检测常用的 SSR引物 名称 及序列 引物名称 SSR引物序列（ 5 ， 3 ， ） Primer SSR 1 上 游 GGTGGTGGGCTGGGGAGTA 下 游 CGTCGATCGATTCATAACCGTAGA Primer SSR 2 上 游 ATACAATCTTCGTGACTCTACAG 下 游 AGCATCAACGCCAACTTTATCC Primer SSR 3 上 游
30、GACGCCTCAATTGCTTACTT 下 游 AGGGAATGAGGATGGGTCTG Primer SSR 4 上 游 TCTCGAAACCCAGCATCAGA 下 游 GTGGAATGGAAACCCCAGAA Primer SSR 5 上 游 TGCTTGCAGAAAGACGAACA 下 游 TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT Primer SSR 6 上 游 TGCTTGCAGAAAGACGAACA 下 游 TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT Primer SSR 7 上 游 GCGGCAAAAACGGGCTCATTA 下 游 CTCTCCGGCTTCTTCCTCACCT
31、CT Primer SSR 8 上 游 CTTCCAGTAGCCATTGTTGA 下 游 ATCGGGTTTTATACTCCTGAA Primer SSR 9 上 游 AGCCGCTTCCTTTTCACTCCACT 下 游 CCCTTCCTACTTCCCCTCACAGAT Primer SSR 10 上 游 TCGTTGCGTTTGAATGTT 下 游 CTCGTGGAAGCGGTTAC Primer SSR 11 上 游 CCTCTCCGGCTTCTTCCTCACCT 下 游 GCGGCAAAAACGGGCTCATTAC Primer SSR 12 上 游 CTTTTGCTGCCCGACGA
32、GA 下 游 AAGGAAGCAGGAAAGAGATAAAAG Primer SSR 13 上 游 GATGGCTCCGGCAAGGTC 下 游 TTAACAAAAGATCCAAAAAGAAAC Primer SSR 14 上 游 TTCCGTCCCTTCCCTAAACA 下 游 GAACACTACTGCCCAGAGAACAC Primer SSR 15 上 游 CGTCCGTAGCGCTATTTTTCAGA 下 游 ACGTTGTCGATCGCCCAGTTC Primer SSR 16 上 游 CGTTGCAGAATGTAGGAAGAGA 下 游 AGAGGGCCCCAAGAAAACT DB
33、11/T 8292011 12 表 B.1 白菜品种纯度检测常用的 SSR引物 名称 及序列 （ 续） 引物名称 SSR引物序列（ 5 ， 3 ， ） Primer SSR 17 上 游 TCGGCGATGGCTCTTTTCACC 下 游 AAGGATCGTTCAGCGGAGAGTAT Primer SSR 18 上 游 AGTTGGCCCCATTTCATTGTTAT 下 游 CATCTTGACGGCCTCCATCTCCA Primer SSR 19 上 游 CAAACTCCCCCAGATCCCCAAACC 下 游 CGAGCGCGAACATGAGGAAGAGAA Primer SSR 20
34、上 游 CGCAGAGACGGTTCAGT 下 游 TACGTGTTACATCTTTATTATCCA DB11/T 8292011 13 B B 附 录 C （ 资料性附录） 白菜真实性 鉴定常用的 ISSR引物 名称及 序列 表C.1给出 了 白菜真实性鉴定常用的 ISSR引物名称及序列。 表 C.1 白菜真实性鉴 定常用的 ISSR引物 名称及 序列 引物名称 ISSR引物序列（5 ， 3 ， ） Primer ISSR 1 AG AG AG AG AG AG AG AG T Primer ISSR 2 AG AG AG AG AG AG AG AG CG Primer ISSR 3 GA
35、 GA GA GA GA GA GA GA C Primer ISSR 4 AG AG AG AG AG AG AG AG CC Primer ISSR 5 AG AG AG AG AG AG AG AG GA Primer ISSR 6 GA GA GA GA GA GA GA GA CC Primer ISSR 7 AG AG AG AG AG AG AG AG TA Primer ISSR 8 AG AG AG AG AG AG AG AG GC Primer ISSR 9 GA GA GA GA GA GA GA GA AT Primer ISSR 10 GA GA GA GA GA
36、GA GA GA T Primer ISSR 11 GA GA GA GA GA GA GA GA TC Primer ISSR 12 GA GA GA GA GA GA GA GA TG Primer ISSR 13 AG AG AG AG AG AG AG AG TC Primer ISSR 14 AG AG AG AG AG AG AG AG TT Primer ISSR 15 AG AG AG AG AG AG AG AG GT Primer ISSR 16 AG AG AG AG AG AG AG AG GG Primer ISSR 17 GA GA GA GA GA GA GA G
37、A AC Primer ISSR 18 GA GA GA GA GA GA GA GA AG Primer ISSR 19 GA GA GA GA GA GA GA GA TA Primer ISSR 20 AG AG AG AG AG AG AG AG AT Primer ISSR 21 GA GA GA GA GA GA GA GA CG Primer ISSR 22 GA GA GA GA GA GA GA GA GT DB11/T 8292011 14 表 C.1 白菜真实性鉴 定常用的 ISSR引物 名称及 序列 （续） 引物名称 ISSR引物序列（5 ， 3 ， ） Primer
38、ISSR 23 GA GA GA GA GA GA GA GA GC Primer ISSR 24 CT CT CT CT CT CT CT CT G Primer ISSR 25 CT CT CT CT CT CT CT CT GA Primer ISSR 26 CT CT CT CT CT CT CT CT AC Primer ISSR 27 CT CT CT CT CT CT CT CT GG Primer ISSR 28 TC TC TC TC TC TC TC TC A Primer ISSR 29 TC TC TC TC TC TC TC TC C Primer ISSR 30 C
39、A CA CA CA CA CA CA CA G Primer ISSR 31 CA CA CA CA CA CA CA CA GT Primer ISSR 32 CA CA CA CA CA CA CA CA AG Primer ISSR 33 CA C CA CA CA CA CA CA CA Primer ISSR 34 AC AC AC AC AC AC AC AC T Primer ISSR 35 AC AC AC AC AC AC AC AC C Primer ISSR 36 AC AC AC AC AC AC AC AC CT Primer ISSR 37 AC AC AC AC
40、 AC AC AC AC CA Primer ISSR 38 AC A TG TG TG TG TG TG TG Primer ISSR 39 CAG CAG CAG CAG CAG G Primer ISSR 40 TCC TCC TCC TCC TCC C DB11/T 8292011 15 C C 附 录 D （规范性附录） 白菜基因组 DNA提取方法 D.1 白菜基因组DNA提取方法 一 D.1.1 白菜单粒干种 子夹在硫酸 纸（称量用） 中 砸碎 ，放入 1.5mL离心管中 。每管加入1%SDS-DNA提取 液 100L，混匀 。单株幼苗 放入1.5mL 离心管中 ，每 管加入1%S
41、DS-DNA 提取液200 L及少量 石英砂,用 尖 头玻璃棒碾碎 ， 混 匀。 D.1.2 将1.5mL离心 管置于80 90水浴锅中 水浴10 min ，水浴过程 中混匀2 3次。 D.1.3 将1.5mL离心 管从水浴锅 中 取出 ，放入离心机中12000r min离心5min。 D.1.4 每管取上清液10 L，加入到 一个新 的1.5mL离心 管中 ，里面预先放入 1 TE缓冲 液（pH8.0 ）90 L，混匀， 12000 rmin稍做 离心后， 作为下 一步SSR或ISSR扩增 的 DNA模板 ，或放入 4冰箱 备用。 D.2 白菜基因组DNA提取方法 二 D.2.1 白菜单粒干
42、种 子或单株幼苗 放入1.5mL 离心管中 ，每 管加入1%SDS-DNA 提取液300 L及少量 石英 砂,用尖头玻璃棒碾碎 ，混匀。 D.2.2 将1.5mL离心 管置于65 水浴锅 中水浴30 min， 水浴 过程中混匀2 3次。 D.2.3 将1.5mL离心 管从水浴锅 中 取出 ， 每管加 入300 L饱和 酚:氯仿:异 戊醇混合 液(25:24:1)， 混匀 ， 12000rmin 离心5min 。 D.2.4 将每管中的上 清液移入到 一个新的1.5mL离心管 中， 加入2/3体积预 冷的异丙醇 ，1/10体积 的3m ol/L乙酸钠 溶液，混 匀，-20冰箱放置 20min，
43、充分 沉淀DNA。 D.2.5 12000 rmin 离心5 min沉淀DNA 。 D.2.6 每管加入70 乙醇300 L，12000 rmin 离心1min， 清洗DNA，清 洗过程重复 2次 。 D.2.7 室温晾干DNA， 加入1TE 缓冲液（pH8.0）50L 100 L充 分 溶 解 DNA， 12000rmin稍做 离心 后，作为下 一步SSR或 ISSR扩增 的DNA模板 ，或放入 4冰箱备用。 D.3 白菜基因组 DNA提取方法三 使用商品化 的植物基因组DNA提取试剂盒 ，进行 白菜 单粒干种子或单株幼苗 基因组DNA的提取。 D.4 DNA质量检测 D.4.1 DNA质量
44、检测方法一 将提取的白菜样 品DNA适当 稀释，用紫 外分光光度 计在 260nm波长和 280nm波长 处测定并记 录其紫外 光吸收率， 质量好的 样品DNA溶液 OD260 nm/OD280 nm的 比值应 在 1.82.0 之间。 D.4.2 DNA质量检测方法二 DB11/T 8292011 16 在 1%琼脂糖凝胶 中，每个提取 样 品 加入约50ng 100ng样 品 DNA，5V/cm的条件下 电泳，加EB 染色。 提取质量好 的样品DNA 应是一条 没有拖尾 的亮带 ， 提取 质量较差的 样品DNA有 拖尾现象 ， 靠近胶 底部的 亮 带是样品DNA 中混杂的 RNA。 DB1
45、1/T 8292011 17 D D 附 录 E （规范性附录） 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 E.1 凝胶制备 将玻璃板洗 净， 用无水乙 醇擦洗两 遍， 干燥。 在长 玻璃 板上涂0.5% 亲和硅烷 （bind- silane ） 0.5mL， 带凹槽的玻璃 板上涂2.0%疏水 硅烷 （ repel- silane） 0.5mL， 操作 过 程 中防止两块 玻璃板互相污染 。 待 玻璃板彻底 干燥后， 将长玻璃 板水平放 置，在玻璃 板上 面垂直方 向两边放 置边条， 并与玻璃 边缘对齐 。 然后， 将 带凹槽 的玻璃板 放在长玻璃 板 的 上面 ， 四 周对 齐 ， 并在 有 边条 的
46、 两 边用 夹 子 固定 ， 水 平 仪 调平 。 吸 取 6%变性聚丙烯酰胺凝胶80mL ， 加 入 四 甲基 乙二 胺 80mL和25%过硫 酸铵80m L， 迅速摇 匀 。 在 凹槽 一端， 沿灌 胶口一边轻轻敲打 ， 一边将 胶灌进， 灌胶 过程中防止 出现气泡 。 待胶流动到另一端后， 在 凹 槽一端，将梳 子 齿 向外 ， 轻轻 的插入梳 子，使其 聚合 1h以上。 E.2 预电泳 拔出已经聚 合好的胶 板上的梳 子。 将胶 板的正、 反面 用水清洗干 净， 擦干 ， 装在电泳 槽 上 ， 用 夹 子 夹 紧 。 在 正 极槽 （ 下 槽 ）和 负 极 槽（ 上 槽 ） 中 分 别
47、 加 入 1 TBE缓冲 液 600mL， 接通电 源， 90W恒 功率预电 泳15min20min。 E.3 点样 在20m l PCR扩增 产物中加 入5m L 6倍 变性 加样缓冲 液 ， 混 匀 后 ， 在 PCR仪上变性： 95 变性5min， 4 冷却10min。用 吸 球 吹吸加样槽 ,清除气泡 和 残 胶， 插入 样 品 梳 子， 每 一个 加样孔点 入5m L扩增产 物。 E.4 电泳 90W恒功率电泳 1h1.5h。 E.5 染色 电泳结束后 ，分开两 块玻璃板 ，按以下 步骤进行 染色 ： 固定：将胶 板放入 10%冰乙酸 固定液中 ，轻轻晃 动 5min； 漂洗：双蒸
48、水漂洗胶 板 3次， 每次 2min； 染色：将胶 板放入 0.2%硝酸银 溶液中， 染色 5min； 漂洗：双蒸 水快速漂 洗胶板 1次，时间 不超过 10s； 显影：将胶 板放入显影 液 中 ,轻轻 晃 动 至带 纹 清晰 显现 ； 定 影 ： 将 胶板 放入 10%冰乙酸 溶液中， 定影 5min； 漂洗：双蒸 水漂洗胶 板 1 min，室温晾干 胶 板 。 E.6 记录 DB11/T 8292011 18 对 胶 板上显 色的条带 进行观察 记录并照 相。 DB11/T 8292011 19 E E 附 录 F （规范性附录） 5%非变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳 方法 F.1 凝胶制备 将
49、玻璃板洗 净， 用 无水乙醇 擦洗两遍 ， 干燥 。 在 长 玻璃 板上涂0.5% 亲 和 硅烷 （ bind-silane） 0.5mL， 带凹槽的玻璃 板上涂2.0%疏水 硅烷 （ repel- silane） 0.5mL， 操作 过 程 中防止两块 玻璃板互相污染 。 待 玻璃板彻底 干燥后， 将长玻璃 板水平放 置，在玻璃 板上 面垂直方 向两边放 置边条， 并与玻璃 边缘对齐 。 然后， 将 带凹槽 的玻璃板 放在长玻璃 板 的 上面 ， 四 周对 齐 ， 并在 有 边条 的 两 边用 夹 子 固定 ， 水 平 仪 调平 。 吸 取 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶80mL， 加入四 甲基乙二胺 80
