1、 河北省地方标准实验动物微生物学与寄生虫学等级标准DB13/ T211一941主要内容与适用范围本标准规定了实验动物微生物学与寄生虫学等级标准的等级分类、检测项目与方法、检验程序与检测方法操作步骤、取样要求、结果判定与报告。本标准适用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、犬和猫等实验动物。2等级分类2.1一级，普通动物:外观健康，无异常，经检测应符合本技术要求中的检测项目动物等级标准。2.2二级，清洁动物:在特定的饲养条件下，经检测应符合本技术要求中的检测项目动物等级标准。2.3三级，无特定病原体动物:在严格控制饲养条件下，经检测应符合本技术要求中的检测项目动物等级标准。2.4四级，无菌动物:在无菌
2、条件下饲育，经检测应符合本技术要求中的检测项目动物等级标准。3检测项目与方法3.1感官检查:动物应外观健康，活动自如，毛色光滑，体表、四肢，尾、眼、脸、口鼻、耳、肛门与外生殖器均无异常。3.2病毒学检测等级标准:病毒学检测项目与方法，应符合附录A A1规定。3.3细菌、真菌、支原体检测等级标准:细菌、真菌、支原体检测项目与方法，应符合附录A A2规定。3.4寄生虫学检测等级标准:寄生虫学检测项目与方法，应符合附录A A3规定。4检验程序与检测方法操作步骤4.1检验程序如下图:刚b首技术监粉局1994-03-2用脸准1994-04-01实施DB13/211-94血徐片，抗体一真菌检查肠内容物、一
3、气管分泌物、肠内容物、平甲网甲画查-检查内虫检体生虫寄生便寄生虫检查脏器分离微生物;如发现有病变时，须进行病理学检查。4.2.检测方法操作步骤见附录B6取样要求5.1取样和取样时间6.1.1小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠一级，普通动物:每年送检动物一次，两次间隔一年。二级，清洁动物:每年送检动物一次，两次间隔一年。三级，无特定病原体动物:每年送检动物一次，两次间隔一年。四级，无菌动物:每年送检动物一次，两次间隔一年;对于动物的生活环境标本和粪便标本，须每月检查一次。6.1.2兔、犬、猫DB13/ T211-94每年送检一次动物的咽拭子、血清标本、粪样和尿样。6.1.3监督单位认为必要时，可随时抽查。6
4、.2取样数量6.K每一个小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠生产繁殖单元采样数量如下:一级动物:至少送检10只;二级动物:至少送检6-10只;三级动物:饲养于隔离器内的动物至少送检2只，饲养于SPF生产单元的动物至少送检6只。四级动物:参照三级动物。6.2.2兔、犬、猫按6.2.1要求，送检动物的咽拭子、血液标本、粪样和尿样。.体外寄生虫(如靖虫等)则由饲养单位定期自行抽样检查，由河北省实验动物工作主管部门指定监测单位认定。6.3取样方法6. 3.1送检动物标本，以随机采取方法抽样，送检成年动物;6.3.2送检动物容器，应按动物级别要求，安全送达实验室;6.3. 3动物标本应当日按病毒、细菌、寄生虫学的要求
5、，联合采样检查。6结果判定与报告6. 1结果判定:在检验结果中如有一项指标不符合附录A的要求时，则判定为不符合本级别要求。必要时可重新采样，对不合格的指标进行复验，如仍不合格，则维持原判定结果。6.2报告:检查的动物，均应由有关检查单位负责人签发检查报告，并交送检单位与上级主管单位。附录A小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、犬和猫类的检测项目与方法A1病毒学检测项目与方法劝.，吸套.小大.哪免大.皿砚.位立方性偏琳巴二性眯络从.皿负拐病毒Lymohocytie Choriomeninitim.SL坦As.口。H!盆位生性出血拍病病二，iaootlc.，位ootie甘smorrhagicp.，.，Vi
6、rum(LC从)Hemorrhagic Fever甲irum(SHFV)二口LIRA. IFA盛r矗，B小峨二翻翻毒(.位拐.)Betromelia甲irnm(po:viram of mice)兔出血住拐病毒OBabbit Hemorrha砂cDime“ Virus皿LISA. 1Z几。.皿LBBA. HI.，.护，.砂Rabbit Hemorrhagic Dime二Virum(SHDV)任大翻偏.Sabiem Virus(RV)大.小翻*Canine Parvovirnm(CPV)大位趁病.Canine Dimtem，二Vlram(CDV)犬(I性肝悦病*CanineV色7L日.，.几泣t已
7、.Virum(CAV-1).任白翻.成少住拐老Fslise Paaleahopsina vi，二(FPV)甘蕊SLH1A中一该.偏.分自HA. HI. SLIBA一分气BLIBA中和试.IFA. SLWA*MjrttHI拐.分.IFA中和试，口，.肝盛偏李M。二Hepatitis Vir二MHV)伯台翻母Bendel Vi，二二杯样翻.Feline Calicivirum(FCV).翻.性气，眨翻幸Feline Bbinetracbsitta VirusZUNI IFA三Ll月。】1几。.盆:nA.居乙1.点DFA。中和健.HI伯台病*Boudai Virus小峨肺拢摘.Pneamonia V
8、irus of Mice(PVM)呼.皿.弃.组盆二，virus，.鱿ROD幻小.悦价Memos Racephalonyolitis Virus小皿.拐.Y。二A denom irua(Y A D)小二小病*Minute Virus of Iiee(MVH)多.翻* Polpom a补，.转伙翻介Botarirae大.烟小病H-1株Sat Parrorirms B-1大二小拐. 1v株二Parrori，二皿甲大皿尼伏翻al大日一祖.斑翻*Net Co，二V Irma(皿C V) Blalodae厅oa口 af1o甲Irme(BDAV)BL妈点。皿点。妞I.L班A.】几A。t奋盈.BLISA.】
9、月几。甘点BL功A。口几。口点BLISA.】珍么.EE*AHI.】rA。IRABL口.招。口点.HI.BLISA.口.口几HI.HI.BL田.】，盆BLEBA.习万点BL臼A、】皿盛.口点不.有，位出的启幸4注:0.要求没有.必纽位查0BLISA:醉联免疚吸附试脸璐:玻片免疚.试脸IFA:兔疚炙光试脸HI:血扭抑翻试脸AA:血扭试脸口报防接种.有保护性杭体，无病厦。A2细菌、真菌、支原体检测项目与方法病原体动物种类位洲方法小大地耳免犬猫峨巨食巨钾沙门氏菌Salmonella SP盆石。，毛，:。、。，、，。mentaarophy。二动_物石，样小抽子曰Microsporum qyp“二羊毛状小
10、抽子菌，Microsporum Lanosom布.氏菌Hrucslla曰映.细.分离培养血谓劝片妞纽真，培猫鑫定真窗培养盆定真，培养鉴定血份玻片妞集二二细百分有培养血淆玻片扭集细口分离培养血油玻片扭.润原体分离培养鉴定BLISA细蔺分离培养血摘玻片报集该检病原体姻苗分离培扑鉴定细日分离培养鉴定细蔺分有堵养鉴定细曲分离培葬鉴定细口分离培养盆定细蔺分离培养鉴定无任何可查到的细菌.丈菌，支旅体注:.要求没有.必组幢查A9寄生虫学检侧项目与方法，生虫劝.种典位.方挂小大抽耳免大.峨皿二级瓢”生“，“”.”弓形体T.二.plasma tondii.O O二二脸任枯，份，.阅佳血.试.，.日日(仲段方位)
11、二份二.二!接.片.查赶.，片，住.片二查虫即.及幼山位变通.旅峨枯.位.由，宜接价片妞.，血.吐甸片二宜挂旅片二交血.Y搜价片侣.班自.A侠.片二立生.二.位扭.称一切容生虫住:.县农扭有。必纽.交:O.，时位立Tees吸片虫体过筑化二免位雄色试位二片lox lama，.DB13J T211-94附录B小鼠、大鼠、地鼠、豚邑、家兔、犬和猫类的徽生物学与寄生虫学检测方法操作步骇B1酶联免疫吸附试验(ELISA)示意图此法系用酶标记一种抗待检动物免疫球蛋白，检测该动物群中多种病毒抗体。包被抗原(特异性抗原，正常抗原)37 0C孵育一小时置4冰箱16-18/j、时洗涤，叩干杏封闭37 0C孵育一小
12、时杏力口样轻微振荡6-1。秒钟杏37孵育11.6/j、时杏洗涤，叩干备加酶结合物，37 0C孵育1-x1.6小时用洗涤液洗4次再用底物缓冲液洗一次鑫加底物37 0C孵育3。分钟杏阳性对照血清孔呈现颜色，加终止液吝酶标仪读取光密度值DB13/1-211-94_ELISA用光密度(OD)值判定阳性方法:1、以标本OD值阴性对照平均OD值加3个标准差作为结果定值的域值。2、以P了ICI值2.1为阳性P了N值2.1而1.6为可疑P/N值阴性对照OD值x3判为阳性4、正常抗原OD值超出正常范围，应当重试，一般均在。.1以下。B2玻片免疫酶试验(TEA)示意图滴加待检血清，已知阳性血清、阴性血清、PBS备
13、保沮37C 30分钟用洗液洗三次.每次浸泡6分钟鑫甩干加结合物毒保H70 30分钟用洗液洗三次，每次浸泡6分钟备甩干底物液浸泡6分钟鑫用洗液洗一次，燕馏水洗一次各待干镜检判定结果DB13/ T211-94_B3免疫荧光试验(IFA)示意图滴加待检血清，已知阳性阴性血清、PBS吝保温37 0C 3。分钟PBS洗三次，每次浸泡6分钟丢甩干滴加荧光抗体丢保温37 C 30分钟PBS洗三次，每次浸泡6分钟杏燕馏水洗一次丢加甘油，加盖破片杏镜检判定结果B4血球凝集(HA)和血球凝集抑制(HI)试验示意图:B4. 1血凝素滴定病毒液稀释丢加等量红血球悬液丢摇匀4或其他温度1小时丢判定血凝效价_一卫DB18
14、/ T211-94一一一一一一一一B4. 2血凝抑制试验待检血清处理血清稀释(作血清对照)名加B-16单位血凝素(核对血凝单位)杏摇匀22或所需温度作用SO分钟各加红血球悬液(作血球对照)毒摇匀4或所需温度1小时咨判定血凝抑制效价Bb沙门氏菌属(Salmonella Sp.)检侧方法操作步骤示意图，直、结肠、回盲部内容物SS, DLSA或HE, DHL分离370C 24h“SCM增菌37过夜杏从每块平板上挑选可凝菌落3个以上，接种TSI或综合，37培养20h鑫TS,:底层黄色，多数产生HIS,斜面碱性红色，产酸产气综合:底层绿色，产酸产气、有动力，中立段黄色。并多数产生HIS,斜面碱性，红色杏
15、初步生化鉴定硫靛PH7.2氢赖化基尿素化氨氢质鑫钾酸反应序号:A、反应序号:A:反应序号:B、反应序号:A, A B B B,奋.甘露醉、山梨醉血清学分型鸟氮酸ONPG非沙门氏菌棉子精动力血清学分型沙门氏菌非沙门氏菌丢报告B6多杀巴氏杆菌(Pasteurella multooida)检侧方法操作步骤示意图:检样:鼻咽部或气管分泌物、病灶分泌物今血琼脂平板3724-48hr丢挑选可疑菌落杏血琼脂平板或血斜面3718-24hr鑫生化实验鑫镜检(革兰氏染色)溶动过氧葡乳靛甘硫麦血力氧化萄糖基露化康化酥糖一质醉氢凯酶+l+琼月旨i报告B7支气管败血性波氏杆菌(Bordetella bronchisep
16、tica)检侧方法操作步骤示意图:检样:鼻咽部或气管分泌物，病灶分泌物丢血琼脂平板姜3724-48hr挑选可疑菌落吝血琼脂平板或血斜面落3718-24hr生化试验镜检(革兰氏染色)血清(无)葡尿硝靛拘动硫溶琼麦萄素酸基椽力化血脂康精醉盐质酸+氢+凯一+一盐一i报告一止)B1317211-94一一一一一一一一一B8支原体(M ycopladm a)检测方法操作步骤示S链气管或1和中耳、生殖道冲冼液杏支原体半流体培养基杏37C 6% CO:或厌氧培养7天出现可疑菌落丢不出现可疑菌落杏支原体液体培养基(分纯培养)每7天盲传一次半流体培养基共传两次丢37 0C 6% CO:或厌氧培养7天今支原体固体培
17、养基仍无可疑菌落生长生长抑制试验菌落观察杏阴性1报告_.一p鱼3/T211-94一一一-B9鼠棒状杆菌(Corynebacteriun muris)检侧方法操作步骤示意图被检动物采血分离血清鑫血清学检查凝集反应气管分泌物、病灶组织姜麦康凯琼脂平板，血琼脂平板鑫挑取可疑菌落备涂片镜检破片凝集生化试验尿葡乳麦甘蔗溶素萄糖芽露糖血酶糖一精醉+-+一备报告一一一一一一一一一一一一一一一D:B10嘈肺巴氏杆菌(Pasteurells Pneumotropica)检侧方法操作步骤示意图鼻咽部或气管分泌物，病灶杏血琼脂平板3718-24hr杏挑取可疑菌落1血琼脂平板3718-24hr一生化实验镜检革兰氏染色
18、靛氧硫动溶麦基化化力血康质酶氢-一凯+一培报告DB13/ T211一舰B11肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pneumoniae)检侧方法操作步葬示意图:气管分泌物、回盲部内容物、丢S. S琼脂平板麦康凯脂平板番36士1挑取可疑菌落备克氏双糖铁琼脂杏36士1病灶皮毛等24h24h柠桩酸盐+vP试验+赖氨酸脱梭酶+姗试验卫矛醉乳糖+葡萄糖+杏报告DB13/ T211一料B12金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)检侧方法操作步骤示意图:气管分泌物，迥盲部内容物、病灶、皮毛等杏一7.6%氯化钠肉汤增菌36士1C 24hr血平板，高盐甘露醇平板备36t 124hr血平板(
19、分纯培养)36士124hr革兰氏染色甘露醇阳性溶血情况血浆凝固酶试验报告。18.DB13/ T211-94B13肺炎链球菌(Streptocoecue Pneumoniae)检测方法操作步骤示意图:气管分泌物、病灶杏直接分离羊血琼脂平板37-C，CO:下培养24-48hr冬挑选可疑菌落接种血平板、分纯，37-C C O:下培养24hr备革兰氏染色:G，双球菌胆盐溶解试验:阳性荚膜染色试验:阳性小白鼠毒力试验:阳性杏报告一一一一一一一一一一一一一一一B13IT211-94B14溶血性链球菌(Hemolytic Streptococcus)检翻方法操作步骤示意图:检样气管分泌物、病灶直接分离血平板
20、或选择性SF平板链球菌增菌肉汤10% CO, 370C 24hr10% CO,37培养14hr革兰氏染色挑选可疑菌落进行分纯，37 0C，划线血平板上,CO:下培养24hr革兰氏染色6. 6% Nacla一溶血日一溶血精氮酸马尿酸钠七叶灵+链状告 报DB13/ 7211-94B16绿脓假单胞杆菌(Paeudomonae aeruginosa)检测方法操作步骤示意图:回盲部肠内容物、伤口分泌物、周围环境物杏NAC增菌液3718一24hrNAC琼脂平板或EMB琼脂平板1S- 24hr普通斜面1 37生化实验1824hr镜检革兰氏染色)鞭毛染色单毛菌产氧硝乙氧动色化酸酞化力素酶盐胺葡+还酶萄血清学分
21、型糖+血清学分型报告DB13了TZll-94B16真菌(Mycological examination)的检侧方法操作步骤示意图:标本(皮毛)养 培 离 分丢直接镜检纯培养丢菌落的观察鑫鉴别培养涂片镜检小培养生化试验备报告结果_卫耳null旦进丝縩一null94_一null-一-B17爱美尔球虫(EimeriaSP)检测方法操作步骤示意图采集标本直接涂片法兔、豚鼠等动物杏粪便漂浮法动物解剖兔卵囊抱子化显徽镜检查鑫报告结果一一一一一一一一一一一一一一)B13/竺11-94一一曰一一B18弓形体(Toaoplasma gondii)间接血扭试脸娜到B18. 1操作步骤:B18. 1. 1抗原制备:
22、取弓形体感染的小白鼠腹水。.1m1,腹腔接种健康小白鼠,3-r4天后处死.每只腹腔注入无菌生理盐水lml，反复洗涤3次，吸出洗液(出血者弃去,3000转/分，离心16分钟，弃上清液，沉淀物用生理盐水洗涤.3次，加人30-4。倍量的。.25%胶旦白醉磷酸缓冲液(0. 2M, PH7. 6)混匀，38水浴中消化，。分钟，再以生理盐水洗涤6次，消化1次，离心海锋3次，加无菌双燕水2m 1/每10只感染鼠，-20冰箱反复冻触6次，300。转l J1- r离心3。分钟，取上清液，加-VF Ik 1. 7% Naol作成抗原原液，侧定工作浓度，分装，低温冻结保存备用。B18. 1. 2致敏绵羊红细胞制备:
23、无菌手续采雄性绵羊血1份(视需要而定)，加Alsever氏液1-1.6份，混匀，“置4冰箱2-3天，然后用0.11M. PH7. 2PBS液离心洗涤6次后配成8 %悬液。1份8 0/0悬液滴加1份PH7. 2、浓度3%的丙酮醛，室温下连续摇动17-18小时、，用PBS液离心备次后，配成8 %悬液，1份8%悬液加1份3%甲陇液，在室温下连续摇动17-18小时，再离心洗涤6次，用P RS液配成10%浓度，此即方双醛固定绵羊红细胞悬液，加0. 196o垂氮钠防腐，4冰箱存放，可使用3个月。取双醛固定红细胞若干，用PBS液洗涤1次后配成2.6%浓莞，加等量1:20000三酸(新配)混匀，.37水浴中三
24、化16分钟，3000转1分，离心10分钟，去上清.用PBS液离心洗涤1次后配成2.5%悬液。取此2.6%浓度、橄化后红细胞悬液4ml注人10毫升离心管中，离心弃上清，用OAM, PH4.8醋酸缓冲液离心洗涤1次，去上清.加弓形体抗原0. 2-,- 0. 3ml(视工作浓度)，再加上述醋酸缓冲液至lml刻度处混匀，37水浴中作用1小时，不时摇动，用含1%健康兔血清磷酸缓冲液离心洗锋6次配成1%浓度(加至刻度一处)，加0.1960亚甄钠.防腐，贮4冰箱备用。B18.1.3对照绵羊红细胞制备:同致敏绵羊红细胞的制备，不同的是以生理盐水代替弓形体抗原。B18.1.4稀释液制备:0.1M, pH7. 2
25、PBS液中加人1%健康灭活和经绵羊红细胞吸收的兔血清，且弓形体间接血凝试验阴性，加0.196,盈扭钠。一一一一一一一一一一一一一一卫B18/ 7211-94、-一一一一B18.1.6间接血凝试验:B18. 1.6. 1稀释血清:在徽乳塑料板每孔加。. 06ml稀释液，吸0. O6ml侍检血清加人第一孔内混匀，再吸出0. O6ml加人第二孔内，依次稀释，末孔为空白、阳性、阴性对照。B18. 1. 6. 2滴加抗原:每份稀释好的血清，第1排每孔滴加致敏绵羊红细胞0. 026m1,第2排每孔滴加对照绵羊红细胞。. 026ml。各份血清以此推。B18. 1.6. 3振荡将加好抗原伉体的塑料板置振荡器上
26、振荡1分钟，使抗原抗体充分结合，室温下放置，过夜后判定结果。B18. 2结果判定标准:+:红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央沉点小如针尖或无。料+:红细胞虽呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点也较大。+:红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大。+:红细胞沉于中心，周围有少量颗粒状沉着物。一:红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚。出现+的血清最高稀释倍数为凝集效价。1:64为阳性。待检血清用前褥经“水浴灭活30分钟。血清轻轻加人孔底，每孔反复吹吸3遍，红细胞沿孔侧壁从高稀释度至低稀释度缓缓加入，空白对照孔先加，吸管专用，管头避免接触血清，严防气泡产生。稀释液、3%丙酮醛、3%甲醛、蹂酸液均临时现配。T Alsever氏液:PBS液(0.11M, pH7.2);3%丙酮醛液;3%甲醛液;1:20000样酸液;醋酸液(0. 1 M、PH4. 8)。附加说明:本标准参照了:中华人民共和国卫生部医学实验动物标准、(1992年)，北京医学实验动物标准(1992年)以及国际实验动物科学委员会(ICLAS),世界卫生组织(WHO)和日本等有关单位的参考资料。本标准由河北省实验动物管理委员会提出。本标准由河北省实验动物管理委员会、河北省实验动物管理委员会专家委员会负责起草。本标准主要起草人:病毒部分吕占军徐增年。细菌部分王俊，。寄生虫部分王松山。本标准由河北省实验动物管理委员会解4t、-
