1、ICS 67.080.01 B 31 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2456 2017 番茄苗期抗黄化曲叶病 毒基因快速检测技术规程 2017 - 03 - 29 发布 2017 - 06 - 01 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/ T 2456 2017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农林科学院提出。 本标准起草单位：河北省农林科学院经济作物研究所。 本标准主要起草人：吴志明、李亚栋、耿保进、高慧敏、 田玉 、 孙英焘、孙世卫、寇慧苹、冯贺敬 。 DB13/ T 2456 2017 1 番茄苗 期抗黄化曲叶病毒 基因
2、 快速 检测 技术规程 1 范围 本标准规定了 番茄苗期抗黄化曲叶病毒 基因 的检测前准备和检测技术 。 本标准适用于 番茄苗期抗黄化曲叶病毒 基因 Ty-1、 Ty-2、 Ty-3/3a的分子 快速 检测 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 2.1 番茄黄化曲叶病毒病（ Tomato yellow leaf curl virus disease） 为 病毒性病害，病原为番茄黄化曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV or TY），病原 特征及 发病 症状见附录 C。 2.2 番茄抗黄化曲叶 病毒基因 2.2.1 番茄抗黄化曲叶病毒
3、基因 Ty-1 定位在番茄第 6号染色体上 (基因号 )。 2.2.2 番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-2 定位在番茄第 11号染色体上。 2.2.3 番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty-3/3a 定位在番茄第 6号染色体上 。 3 检测前准备 3.1 检测 仪器 组织研磨仪、恒温水浴锅、离心机 、高压灭菌锅、移液器、称量天平 、冰箱 (4 、 -20 、 -80 )、电泳仪、紫外凝胶成像仪、 PCR仪 等 。 3.2 检测 试剂 DNA提取液 (CTAB)、 氯仿 /异戊醇 (24/1)、 乙醇 、异丙醇、 蒸馏水 、 双 蒸馏水 （ ddH2O）、 TE缓冲液(Ph=8.0)、 50 x TAE缓
4、冲液 、 Goldview、 DM2000、 琼脂糖 、 Taq 酶等。 3.3 检测引物 DB13/T 2456 2017 2 表 1给出了 抗 TYLCV的抗病基因扩增引物 。 表 1 Ty-1、 Ty-2 和 Ty-3/3a 检测 引物 基因 染色体 引物 序列 (5 -3) 扩增产物 (bp) 标记类型 Ty-1 6 Ty1 正向 TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC 984（ 抗 ） 1434（感） SNP Ty1 反向 AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC Ty1-3 AAACGCTCTTCTTCCCCTCG Ty1-4 AGTTAGATTCAGGCTCCTC
5、GCA Ty-2 11 Ty2 正向 AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC 194（ 抗 ） 494（感） SCAR Ty2 反向 AGTGTACATCCTTGCCATTGACT Ty-3/3a 6 Ty3 正向 GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC Ty3 450（ 抗 ） 320（感） SCAR Ty3 反向 GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC Ty3a630（ 抗 ） 3.4 DNA 提取 液配制 配制 以下 DNA提取 液 ： a) 100 mmol/L Tris (pH=8.0)； b) 50 mmol/L EDTA； c) 500 mmo
6、l/L NaCl； d) 2 %CTAB（ W/V） ； e) 0.8 %皂土 （ W/V） 。 4 检测技术 4.1 样品采集和保存 采集定植前 番茄苗至少 3个样本， 每个样本随机选取 3 5株， 进行 编号 、保存。 短期保存 温度 4 ，长期保存 温度 -20 或 -80 。 4.2 DNA 提取 DNA提取 按下列步骤进行 ： a) 在 2 mL 离心管加入 0.2 g 左右样本、一粒 磨样珠 ， 用磨样机研磨成匀浆 ； b) 加入 600 l 65 预热的 DNA 提取液 ， 65 保温 30 min 以上 ； c) 加入 600 l 氯仿 /异戊醇（ 24/1），上下颠倒混匀数次
7、，室温 静 置 5 min； d) 6000 rpm 以上 室温离心 10 min， 吸取上清 液 400 L 至 1.5 ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀 ，室 温 静置 5 min； e) 10000 rpm 以上 离心 10 min，弃上清 液 ； f) 加入 1 ml 70 %乙醇洗涤，用手指轻弹使沉淀漂浮于乙醇中 ； g) 6000 rpm 以上 离心 5 min，弃上清 液 ，将离心管倒扣在滤纸上，风干 DNA； h) 加入 50 L TE 缓冲液 ； DB13/ T 2456 2017 3 i) 完全溶解后 ， 取 4 L DNA 进行 1%的琼脂糖凝胶电泳分析，
8、剩下的置于 -20 或 -80 冰箱中保存。 4.3 Ty-1、 Ty-2 和 Ty-3/3a 检测 4.3.1 PCR 检测反应体系 PCR反应液体积为 20 L，组分配制应符合表 2的规定。 表 2 PCR 反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积 L DNA 30 ng/ L 50 ng/ L 1.5 ng/ L 2.5 ng/ L 1 10buffer 10 buffer 1 buffer 2 dNTP 2.5 mmol/L 0.15 mmol/L 1.6 Taq 酶 5 U/ L 0.2U/ L 0.2 正向引物 10 mol/L 0.5 mol/L 1 反向引物 10 mol/
9、L 0.5 mol/L 1 ddH2O - - 13.2 4.3.2 Ty-1、 Ty-2 和 Ty-3/3a PCR 反应程序 按下列程序进行操作： a) 94 预变性 5 min； b) 94 变性 50 s， 58 退火 30 s， 72 延伸 1 min30 s， 共 5个循环； c) 94 变性 50 s， 56 退火 30 s， 72 延伸 1 min 30 s， 共 30个 循环； d) 72 延伸 10 min， 4 保存 。 4.3.3 电泳检测 采用 1.5 %（ w/v） 琼脂糖凝胶电泳进行检测。 用紫外凝胶成像仪 记录电泳 结果 。 5 检测 结论与 检测 报告 5.1
10、 检测结论判定依据检测结果 进行 ， 检测 结果显示为电泳图谱 。 电泳图谱 见附录 A。 5.2 填写 检测报告， 检测报告 式样见附录 B。 DB13/T 2456 2017 4 附 录 A （规范性附录） 电泳图谱 注： Ty-1 纯合体 显示 984 bp 条带 ，感病纯合体 显示 1343 bp 条带 ，而杂合体 显示 984 bp 和 1343 bp 条带 。 图 A.1 Ty-1 抗病基因检测 电泳图谱 注： Ty-2 纯合体 显示 194 bp 条带 ，感病纯合体 显示 494 bp 条带 ，而杂合体 显示 194 bp 和 494 bp 条带 。 图 A.2 Ty-2 抗病基
11、因检测电泳图谱 注： Ty-3 a 纯合体 显示 630 bp 条带 ， Ty-3 纯合体 显示 450 bp 条带 ，感病纯合体 显示 320 bp 条带 ，而 Ty-3 /Ty3a的杂合体分别 显示 630/450 bp 和 320 bp 条带 。 图 A.3 Ty3/Ty3a 抗病基因电泳 图谱 DB13/ T 2456 2017 5 附 录 B （规范性附录） 检测 报告 式样 表 B.1 检测 报告 式样 番茄苗期抗黄化曲叶病毒 基因 快速 检测 报告 共 页，第 页（附图 页） 样品名称： 样品编号： 样品数量： 样品性状： 检验项目： 检验依据： 主要仪器设备： 检验条件： 检验
12、时间： 送检单位： 送样时间： 联系地址： 联系电话： 检验内容及结果： 1、 受检样品性状 2、 检验方法 3、 结果 4、 结论 承检单位： 地址： 邮政编码： 联系人： 联系电话： 主检人： 技术负责人： 检验日期： 年 月 日 DB13/T 2456 2017 6 附 录 C （资料性附录） 番茄 黄化曲叶病 病原 特征及发病表现 中 国 番 茄 黄 化曲 叶 病毒 (Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)， 属 于 双 生 病毒科（ Geminiviridae） ， 菜豆金色花叶病毒属（ Begomovirus）病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉虱（ Bemisia tabaci）以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植物 DNA 病毒 植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷 ，叶片增厚，叶质变硬，叶背面叶脉常显紫色。生长发育早期染病植株严重矮缩，无法正常开花结果；生长发育后期染病植株仅上部叶和新芽表现症状，结果数减少，果实变小，成熟期果实着色不均匀 (红不透 )，基本失去商品 价值 。 _
