1、第六章 微生物的生长及其控制,通过本章的学习，要求掌握： 1、微生物生长的研究方法； 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点； 3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响； 4、微生物生长的控制。重点： 细菌纯培养生长曲线，微生物生长的控制。难点：如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的代时和代数。,第一节 微生物生长的研究方法 生长:微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单地说，生长growth就是有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。 繁殖:单细胞微生物如细菌
2、，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分分裂方式形成两个基本相同的子细胞。这种由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖reproduction。,在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。发育:在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育development。如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。,一、纯培养技术
3、,微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。微生物学中将在实验室条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖的后代称为纯培养pure culture。 获得纯培养的方法:1、稀释倒平板法 2、稀释涂布法,3、划线分离法 streak plate method 平行划线 连续划线 此法主要用于杂菌不多的标本。 分区划线 本法适用于杂菌量较多的标本。获得单个菌落。,4、显微操作仪直接挑取单个细胞（适于原生动物、单细胞藻类等） 5、稀释摇管法 （分离厌氧菌） 6、液体培养基稀释分离 7、选择性培养基分离,根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如： 分离真菌用马丁
4、氏培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号培养基，pH中性偏碱。 不同微生物对化学试剂的敏感性不同：从土壤中分离细菌在培养基中加制霉菌素抑制真菌生长；从土壤中分离真菌时，在培养基中加孟加拉红和链霉素抑制细菌生长。 根据分离对象的营养特征分离特殊微生物：分离纤维素分解菌时，培养基以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基，以N2作氮源。,二、微生物生长量的测定,1测定总菌数（即总的细胞数量）： 计数板直接测数 染色涂片计数法 比浊法2. 测定活菌数：（1）稀释平板测数法（2）稀释培养测数法（3）薄膜过滤计数法3.测定细胞生物量：（1）测定细胞干重（2）测定总氮量（3）测定DNA含量(4) 测定A
5、TP含量(5）测定代谢活性,显微计数法,染色涂片计数法取0.01ml的菌悬液放在1cm2 的玻片上，让其干燥，然后固定染色，再置显微镜下计数每一视野中的菌数，算出视野面积，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌数。每ml菌液中的含菌数=视野中的平均菌数1cm2/视野面积100,比浊法比浊法的原理是利用细菌细胞在溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中测定时所吸收的光线越多（即透过的光线少）方法是先要测定出一条标准曲线，即将菌液制成不同浊度的稀释液，将此不同浊度的稀释液用光电比色计测出其消光值，再把这各种浊度的稀释液用显微镜直接计数法测出其中的含菌数，以不同浊度的稀释液的消光值作纵坐标，以不同浊
6、度稀释液所含的菌数作横坐标，绘出标准曲线。有了标准曲线，就可以取未知菌液测消光值后通过查此曲线得知未知菌液中的含菌数。此方法在工业发酵中应用较多，因为它快速，节约时间。,测定微生物的活菌数viable count 稀释平板测数法dilute plate count 以CFU(colony forming units)表示,稀释培养测数法（又称最大概率法，MPN most probable number）,例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下： 稀释度: 103 104 105 106 107 108 重复数: 5 5 5 5 5 5 有菌生 长管数： 5 5 5 4 1 0根据上述结果，数量
7、指标为“541”，查表得近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17105个,薄膜过滤计数法；此法用于计数空气中的含菌数当一定体积的空气通过滤膜后，将滤膜培养后计数滤膜上的菌落数即可求出单位体积空气中的含菌数。,细胞生物量测定 1.细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。（如菌丝干重g/100ml） 2.总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的含量。蛋白质的含量=氮量6.25 3.DNA含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中DNA含量。细菌平均每个含DNA的量为8.4105 ng，若测得某样品中的DNA含量为8.410-2ng，则测定样品中含
8、有1000个细菌 4.ATP含量测定法: 以分光光度法测定它的荧光素荧光素酶反应的强度,经换算即可求得生物量。 5.代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等，它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。,三、同步培养,在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。 同步培养法：能使培养的微生物处于
9、比较一致的生长发育阶段上的培养方法叫同步培养法synchronous culture。,过滤分离法1、机械法 区带离心法膜洗脱法,温度调整法 2、诱导法 营养调整法 芽孢萌发法3、 解除抑制法：采用碟呤等代谢抑制剂阻断细胞DNA的合成，然后大量稀释解除抑制，使细胞同步生长。,机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多，应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解很少，化学诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持23个世代，又逐渐转变为随机生长，即非
10、同步化。,第二节、微生物的生长规律,以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生长，最后一次收获，此称分批培养(batch culture)。利用分批培养可以测定细菌纯培养生长曲线。,一、细菌纯培养生长曲线:将少量细菌的纯培养体接种到新鲜的液体培养基中，定期测定菌体数量，开始时生长缓慢，然后细菌数目以对数增加，继而稳定在最高生长量上，最后逐渐降低，进入衰老死亡阶段，如用座标法作图，以时间为横座标，以菌数的对数增长量为纵座标，可以绘出一条曲线，我们将此曲线叫做细菌纯培养生长曲线。,细菌纯培养生长曲线,细菌纯培养生长曲线的分期及各期特点:延滞期 lag phase （滞留适应期）菌种初接入新鲜
11、培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加但细胞个体体积增大，代谢活跃。对数期 logarithmic growth phase细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用对数期细胞作为扩大培养的种子液。,利用对数生长期测定细菌的代时和代数:在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的即 20 2 1 22 23 2n 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n 个细菌。如果在对数期 开始时间
12、 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数期 后期t2的菌数为 x2，则代时（Generation time，G）（即每增加一代所需要的时间）应为： G=（t2 - t1）/n,先求代数n 由于x2 = x1 2nlgx2 = lgx1 + nlg2 ；n=（lgx2 - lgx1）/lg2 n = 3.3 lg (x2 /x1 ) 即G =（t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1),例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 104 /ml，经过培养 4 h后，又测得菌液中的细菌数为 108 /ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。 根据公式： G = （t2 - t1
13、）/3.3 lg (x2 /x1) t2 - t1 = （4 - 0） 60 min = 240 min x2 = 108 x1 = 104 lg(x2 /x1 ) = lg108 lg104 = 8 - 4 = 4 代入上式 G = 240/3.3 4 = 240/13.2 = 18 min 即在上述培养液中，世代时间为 18 min。 细菌繁殖代数 n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 代。,稳定期(stationary phase)又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐
14、渐趋向零。在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。,稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所
15、消耗的营养物质之间存在着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数。,衰亡期(decline phase)细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。,二、二次生长： 当培养液中同时存在两种均能被微生物利用的主要营养物时， 微生物将首先利用其中较易利用的营养物开始生长。当较易 利用的营养物被消耗 完，进入稳定期后， 微生
16、物经过短暂的适 应，开始利用第二种 营养物，再次开始新 的对数生长，并进入 新的稳定期，表现为 二阶式的双峰生长曲 线，称为二次生长曲 线。,三、连续生长（连续培养）,当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养continuous culture，即在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物长期处于旺盛生长阶段。,连续培养的原理是利用细菌在生长曲线中的对数期生长最快。恒
17、化连续培养连续培养恒浊连续培养恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连续培养。由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜培养液流入和旧培养流出速度，使容器内菌液浓度恒定。工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。,恒化连续培养：控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，又叫恒组成连续培养。这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲，它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤其是DNA、RNA及蛋白质合成的变化；同
18、时它也是研究自然条件下微生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生物一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自然条件相类似。,四、真菌的生长,1、丝状真菌在固体培养基上的生长繁殖,丝状真菌菌丝生长与营养有关。营养丰富，分支多而密，营养贫乏，分支少而稀。 菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。菌丝生长与营养有关，营养丰富则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。菌丝在固体培养基培养时形成菌落。,2、丝状
19、真菌在液体培养基中的生长,丝状真菌在液体培养基中的生长可分为三个生长阶段即:延缓期迅速生长期衰退期,3、孢子生长,真菌无性孢子的形成可分为五个阶段：1、分生孢子梗形成2、核移动到分生孢子梗内3、分生孢子梗膨胀4、顶端出芽，并形成一串互相连通的芽5、芽与芽之间产生横隔，将它们分隔成成串孢子 无性孢子繁殖过程：孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）萌发管形成菌丝生长,包括,真菌有性孢子形成是由于性激素产生，研究较多的几种性激素是：1、三孢酸2、诱雄激素3、成精激素和成卵激素,绵霉的有性孢子形成过程分为以下几个步骤,1、首先由雌性菌体分泌一种类固醇性质的成精激素（antheridiol）
20、，它可以连续不断地产生，并扩散到基质中； 2、雄性菌体在接受成精激素后，会发生多方面反应，促进其本身产生雄器或精子，同时，它可以反过来合成另一种激素称为成卵激素（oogoniol hormone）； 3、雌性菌体在接受成卵激素以前，没有任何形态变化，直到接受了成卵激素后，才促进形成藏卵器，并大量产生成精激素，以吸引雄器或精子； 4、吸引和识别的结果使藏卵器与雄器结合，进行有性生殖。,4、真菌的二型现象,有些真菌，尤其是丝状真菌如毛霉和假丝酵母，在不同环境下，可以从菌丝型变为单细胞出芽酵母型，或者相反，由酵母型转变为菌丝型，这种生长型的转变称为二形现象。二型转变受环境因子的控制。,第三节 影响微
21、生物生长的主要因素,生长是微生物与外界环境因素共同作用的结果。环境条件的改变，在一定限度内，可能引起：A. 微生物形态，生理、生长、繁殖等特征的改变，B. 微生物抵抗、适应了环境条件的某些改变；C. 导致微生物的死亡。,一、温度对微生物生长的影响,微生物生长的温度类型,低温型微生物psychrophiles又称嗜冷微生物，可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。它们或者分布在地球两极地区的水域和土壤中，这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布在平均温度为5左右的海洋中;或者分布在只有12的海洋深处；还有的分布于冷泉。冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。嗜冷微生
22、物嗜冷机理：1、细胞内的酶在低温下酶活性高；2、细胞膜中不饱和脂肪酸含量较高，细胞膜在低温下仍保持半流动状态，从而能进行活跃的物质代谢。,中温型微生物mesophiles它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。室温性微生物适于2030生长，如土壤微生物、植物病原微生物。体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限范围在1045，最适生长温度与其宿主体温相近，在2540之间，人体寄生菌为37左右。 中温型微生物不能在低温条件下生长是由于：1、中温型微生物在低温下蛋白质的合成过程不能启动；2、低温下，受代谢产物的反馈抑制。,高温型微生物themophiles它们适于在4550以上的温度中生
23、长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，比如堆肥在发酵过程中温度常高达6070。能在5570中生长的微生物有Bacillus、Methanobacterium等。分布于温泉中的细菌，有的可在近于100的高温中生长。这些耐高温的微生物，经常给罐头工业、发酵工业带来麻烦。微生物的耐热性一般而言：原核生物大于真核生物非光合微生物大于光合微生物简单生物大于复杂生物高温微生物耐高温的主要原因：1、具耐热的酶和蛋白质及其合成系统2、细胞膜富含饱和脂肪酸，利于膜在高温下保持稳定,二、 pH 值对微生物生长的影响,微生物在 pH49 之间都可以生长。细菌最适 pH 为7.08.0放线菌最适 pH 7.58.5
24、 霉菌、酵母最适 pH 4.06.0藻类 6.07.0 原生动物 6.08.0 pH 值影响微生物生长的主要作用在于： 引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收； 影响代谢过程中酶的活性；改变营养物质的可给性以及有害物质的毒性。,微生物生长繁殖的最适pH与其合成某种代谢产物的pH通常是不一样的。例如丙酮丁醇梭菌生长繁殖最适 pH 是 5.57.0，丙酮丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最适 pH 是 4.35.3。 微生物在不同的 pH 下积累的代谢产物不一样。 黑曲霉在 pH 23 的环境中发酵蔗糖以产柠檬酸为主，产草酸极少；而在 pH 近中性时发酵蔗糖产生大量的草酸，柠檬酸产量很低。,可
25、利用微生物对pH要求的不同，控制杂菌的污染。无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大,很少应用；某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂；酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长。强碱可用作杀菌剂，但由于其毒性大，用途有局限性。如生石灰用于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对G+与病毒比对G-作用强。结核分枝杆菌抗碱力特强。,三、氧与氧化还原电位,根据氧与微生物生长的关系，可将微生物分成五类： 专性好氧微生物Strict aerobes 专性厌氧微生物Strict anaerobes 兼性厌氧微生物facultative aerobes 微好氧微生物microaerophi
26、lic bacteria耐氧微生物aerotolerant anaerobes,五类微生物的比较微生物 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 过氧化物酶专性好氧微生物 + + -专性厌氧微生物 - - -兼性厌氧微生物 + + -微好氧微生物 + + -耐氧微生物 + - +,氧化还原电位（Eh值）与微生物生长的关系影响Eh的因素很多，分子态氧的影响尤为重要。其次是培养基中氧化还原物质的影响。 不同的微生物对氧化还原电位的要求不一样。 好气微生物要求Eh值在 +0.1 伏以上，以 0.3至 0.4 伏为宜。兼性好氧微生物Eh值在 0.1 伏以上行呼吸作用，在 0.1 伏以下行发酵作用。厌气性微生物 Eh
27、 值在 0.1 伏以下为宜。 向培养基中通入空气或加入氧化剂可提高基质中的 Eh 值，以培养好气微生物。在培养基中加入还原性物质如半胱氨酸、亚硫酸钠、Na2S 等可降低基质中的氧化还原电位，以培养厌气性微生物。,第四节 微生物的培养方法,一、实验室培养法 1、固体培养法 好氧菌的固体培养 主要用试管斜面、培养皿琼脂平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等进行培养。 厌氧菌的固体培养 A、高层琼脂柱 B、厌氧培养皿 C、亨盖特滚管技术 D、厌氧罐 E、厌氧手套箱,2、液体培养法 好氧菌的液体培养 A、试管培养 B、三角瓶浅层液体培养 C、摇瓶培养 D、台式发酵罐 厌氧菌的液体培养加巯基乙酸、半胱氨酸、维
28、生素C等降低氧化还原电位，以适合厌氧菌的生长。,二、生产实践中培养微生物的装置,1、固态培养法 好氧菌的曲法培养 厌氧菌的堆积培养法 2、液体培养法 好氧菌的培养 A、浅盘培养 B、深层液体通气培养 三、发酵罐,（1）斜面培养：用于微生物形态观察或菌种保藏。 （2）培养皿平板培养：用于分离和活菌计数。为了获得较多菌体提高培养效率，采用增大培养表面积的办法，实验室采用克氏瓶（茄子瓶）、罗氏瓶、锥形瓶。工厂采用曲盘、帘子以及通风制曲池等方法培养菌体。,厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电
29、势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。 1厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。,3厌
30、氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培
31、养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。,4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装
32、入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。,液体培养法将微生物接种到液体培养基中进行培养的方法叫液体培养法。该类方法有：1静止培养是指接种后的液体静止不动。由于所用容器不同，培养法也不同。试管培养法将菌接种到装有10 ml液体培养基的试管后摇匀，放入试管架上，置于培养箱中培养，定时观察微生物液体培养特征；浅盘培养法，将菌接入装有液体培养基的搪瓷盘内，使液面与空气广泛接触。早年柠檬酸发酵培养黑曲霉时曾用此法。,2摇瓶振荡培养由于其简便、实用，自本世纪30年代问世以来，很快发展成为微生物培养中极重要的技术，广泛用于种子培养、扩大发酵用。摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型（一般摇床须放入恒
33、温室，现已用自动控温的台式摇床）。用旋转式摇床进行微生物振荡培养时，固定在摇床上的锥形瓶随摇床以 200250 rmin的速度运动，由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动。在用往复式摇床进行振荡培养时，培养物被前后抛掷，引起较为激烈的搅拌和撞击。如要获得更大的氧供应，可在较大的烧瓶（250500 ml锥形瓶）中装相对较小容积的培养基（2030 ml）。由此可获得更高的氧传递速率，便于细胞的迅速生长。若要获得较低的氧供应，则采用较慢的振荡速度和相对大的培养体积。,3发酵罐培养一般实验室中较大量的通气扩大培养，可采用小型发酵罐，罐容在 530 L，它可以供给所培养微生物的营养物质和氧气，使微生物均
34、匀生长，大量生产微生物细胞或代谢产物，并可在实验过程中得到必要的数,几个基本概念防腐antisepsis它是一种抑菌作用。利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。消毒disinfection是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。例如将物体煮沸10 min，就可杀死病原菌的营养体，但不能杀死细菌的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。,第五节 微生物的控制,灭菌sterilization是指用物理或化学因子，杀灭物体中的所有生活微生物，包括最耐热的细菌芽孢
35、。这是一种彻底的杀菌措施。通过灭菌的物品不再存在任何有生命的有机体。化学治疗chemotherapy是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。,不同微生物的致死温度不同：多数细菌、酵母菌、霉菌的营养细胞和病毒，在5065条件下12 min可致死；放线菌和霉菌孢子比营养细胞的抗热性强，7680条件下10 min才被杀死；细菌芽孢抗热性最强，100以下处理相当长时间才能致死。例如肉毒梭菌的芽孢沸水中5.0-9.5小时才被杀死。同一菌种不同菌株或不同菌龄，其抗热性也可能不同一般幼龄的比老龄的对热敏
36、感。例如菌龄为1.75 h和2.75 h的大肠杆菌在53加热15 min，其菌数分别下降10，000倍和2， 000倍，而菌龄为62 h，在同样条件下菌数只下降12倍。,同一种微生物在生长发育的不同阶段，对温度的要求不一样:例如：灰色链霉菌的菌体最适生长温度为37，而产生链霉素的最适生长温度为28。又如：青霉素产生菌菌体的最适生长温度为30，而产生青霉素的最适温度为23。又如：黑曲霉菌体生长的最适生长温度为37，而产酶的温度为28。又如：人工栽培的食用菌菌丝生长的最适温度为25左右，而子实体分化的温度通常大都在18左右。培养基的成分对微生物的抗热性也有影响。例如在富含蛋白质的培养基上生长的细菌
37、，可能由于在菌体周围形成了一层蛋白质膜而提高了抗热能力。,一、高温杀菌1、干热灭菌焚烧灭菌法此法灭菌彻底，迅速简便，但使用范围有限。常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。干热灭菌法主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌。通常160170处理2 h便可达到灭菌的目的。此法只适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。其优点是可保持物品干燥。,湿热灭菌煮沸消毒法物品在水中煮沸15 min以上，可杀死细菌的所有营养细胞和部分芽孢。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。高压蒸汽灭菌法 是实验室及生产中常用的灭菌方法。加压则可提供高于100的蒸汽。加之蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性
38、。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。一般培养基、各种缓冲溶液、玻璃器皿等常采用此方法灭菌，其工艺条件为:0.1Mpa /cm2 (121) 处理30 min,手提式灭菌锅的使用方法： 1、加水 2、装锅 3、加热和排除冷空气 4、升压保压、计时 5、降压排汽 6、出锅,灭菌锅冷空气排除程度与锅内温度的关系,间歇灭菌法常压下100处理1530 min，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度(2837)保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。此法的缺点是灭菌比较费时，在缺乏高压蒸汽灭菌设备时可用
39、此方法灭菌。 巴斯德消毒法用较低的高温处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，但又不损害营养与风味。巴氏消毒法的工艺条件为：6263/30 min或71 /15 min这种方法只能杀死大多数腐生菌的营养体而对芽孢无损害。此法是基于结核杆菌致死温度为62/15 min而规定的。,微生物的致死温度在一定时间内（如 10 min）杀死微生物所需要的最低温度称为微生物的致死温度。 微生物的致死时间在一定温度下杀死微生物所需要的最短时间称为微生物的致死时间。温度愈高，致死时间愈短。 D 值 decimus value在特定温度下使微生物菌数减少 10 倍所需的时间。,辐射是指通过
40、空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一地方的能源。它们或是离子或是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和射线等 可见光只有光能营养型的微生物才需要400800 nm可见光进行光合作用。有的微生物对光有趋光性，如闪光须霉。担子菌形成子实体也需要散射光的照射。微生物细胞经照射后，在有氧情况下，产生光化学氧化反应，生成H2O2，能发生强烈氧化作用，引起细胞死亡。,二、辐射,紫外线紫外线对微生物有杀伤作用，UV 的波长在 136400 nm 之间，以波长为265266 nm 的杀菌力最强。在医疗卫生和无菌操作中广泛应用。紫外线穿透能力差，只适用于空气及物体表面消毒。紫外辐射的
41、杀菌机制复杂，最明显的是形成胸腺嘧啶二聚体。UV照射引起的微生物损伤在有光时可在 DNA 修复酶的作用下进行修复，此称为光复合作用，所以微生物经 UV 照射后应放在黑暗处，特别是在诱变育种中。,电离辐射X射线与射线、射线和射线均为电离辐射。它们的波长很短（X 射线0.0613.6 nm； 射线 0.010.14 nm）有足够的能量从分子中逐出电子而使之电离。电离辐射的杀菌作用通过射线引起细胞中水分子在吸收能量后导致电离所产生的自由基起作用。射线是由某些放射性同位素如60Co发射出的高能辐射，具较强的穿透力，能致死所有的生物。现已制出了用于不耐热的大体积物品消毒的射线装置。,干燥会导致细胞失水而
42、造成代谢停止以至死亡。不同微生物种类，干燥时微生物所处的环境条件，干燥的程度均影响干燥对微生物的效果。结核分枝杆菌特别耐干燥，在此环境中，100 20 min仍能生存；链球菌用干燥法保存几年而不丧失致病性。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏。生产或科研中常用真空干燥法来保藏细菌、病毒及立克次氏体。在日常生活中常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。,三、 干燥,四、渗透压,若置微生物于高渗溶液(如20%NaCl)中，水将通过细胞膜从细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液(如0.01%NaCl)或水中，外
43、环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。 由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用的高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。糖的浓度通常为5070%，盐的浓度为1015%。,五、超声波,超声波(频率在20000 Hz以上)具有强烈的生物学作用。超声波的作用是使细胞破裂，几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。淋病奈氏球菌对超声波极为敏感，而发光细胞却要处理1.5 h才死亡。病毒的抗性较强。一般来说，高频率比低频率杀菌效果好，球菌较杆菌抗性强。细菌芽孢具更强的抗性，大多数情况下不受超声波影响。科研中常
44、用此法破碎细胞。,六、化学药物,最低抑制浓度（MIC）：在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度。 半致死剂量（LD50）：在一定条件下，某化学药剂能杀死50实验动物时的剂量。 最低致死剂量（MLD）：在一定条件下，某化学药物能引起实验动物群体100死亡的最低剂量。,重金属盐 重金属离子带正电荷，易与带负电荷的菌体蛋白质结合，使蛋白质变性，有较强的杀菌作用。 升汞（HgCl2 ）：0.050.1% 用于非金属器皿的消毒 。红汞：2% 水溶液用于皮肤，粘膜及小伤口的消毒。 硫柳汞：0.010.1% 用于皮肤及手术部位的消毒，生物制品防腐。 铜盐： 波尔多液含 CuSO4，用来杀真菌，防治
45、植物病害。,氧化剂 高锰酸钾： 0.1% 用于皮肤，尿道及蔬芽，水果消毒。 H2O2： 13% 用于表面消毒如伤口消毒。 过氧乙酸：0.20.5% 用于皮肤、塑料、玻璃、人造纤维消毒。 卤素化合物 漂白粉：1020% 用于地面和厕所消毒； 0.51%的上清液用于空气及物体表面消毒，亦可作饮水消毒剂。Cl2：0.20.5 mg/L 可作饮水及游泳池水消毒剂。 I2：2.5% 的碘酒用于皮肤消毒。,表面活性剂 新洁尔灭： 0.050.1% 用于皮肤，粘膜及外科手术器械浸泡消毒。 有机化合物 酚（石炭酸）35% 用于桌面，地面及玻璃器皿的消毒， 0.51% 用于皮肤消毒。 乙醇：7075% 用于皮肤
46、及器械消毒。 甲醛：2% 的福尔马林用于浸泡器械及物品表面消毒。消毒无菌室及病房可用10% 的甲醛溶液重蒸，也可用36% 甲醛溶液（6 ml/m3）高锰酸钾适量产气熏蒸。,染料 结晶紫： 十万分之一的浓度在根瘤菌培养中可抑制G+ 菌的生长。 孔雀绿： 十万分之一的浓度可抑制金黄色葡萄球菌生长，三万分之一可抑制E.coli生长。 龙胆紫： 24% 用于皮肤和伤口消毒。,石炭酸系数,指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比。 一般规定处理时间为10min，供试菌为Salmonella typhi （伤寒沙门氏菌）,七、化学治疗剂,能直接干扰病原微生物的
47、生长生繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学治疗剂。它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。化学疗剂种类很多，按其作用与性质可分为:抗代谢物抗生素,抗代谢物,磺胺可阻止叶酸的合成。由于磺胺与细菌生长所必须的对氨基苯甲酸（PABA）的结构非常相似，在一定条件下它们竟争性的与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了 PABA 进入叶酸分子中，从而阻止了叶酸的合成。人类不需要自身合成叶酸，故磺胺对人无毒。 异烟肼又名雷米封(rimifon)，是吡哆醇抗代谢物，是最有效的抗结核杆菌的药物之一。它能渗入机体细胞，并作用于细胞内的结核杆菌。,抗生素,抗生素按作用方式分类 作用
48、于细胞壁的抗生素青霉素类、头孢菌素类、杆菌肽、环丝氨酸、万古霉素；多氧霉素 干扰细胞膜功能的抗生素多粘菌素、短杆菌素；制霉菌素、两性霉素；缬氨霉素、莫能菌素；杀螨素。 作用于蛋白质合成的抗生素卡那霉素、链霉素、四环素等主要作用于30S亚基；氯霉素、林可霉素、红霉素等则作用于50S亚基。,抑制核酸复制与转录的抗生素丝裂霉素C(自力霉素)、博莱霉素(争光霉素)、放线菌素D(更生霉素)蒽环类；新生霉素、香豆霉素喹诺酮类；利福霉素 作用于能量代谢系统的抗生素抗霉素、寡霉素,微生物的抗药性由于化学药物的广泛应用，某些病原细菌产生了抗药性,细菌的抗药性表现在如下几个方面： 使抗生素向无活性的形式转化抗生素作用靶位的修饰微生物对抗生素通透性的改变主动外排系统的产生,
