1、第九章 表观遗传学研究实验技术 简介,染色体免疫共沉淀技术DNA甲基化分析技术,染色体免疫共沉淀技术,染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，可用于测定体内结合在特定DNA序列上的蛋白质。该方法主要应用于体内核小体定位、DNA甲基化、组蛋白修饰等方面的研究。,染色体免疫共沉淀技术,染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声破碎将染色质随机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所要研究的目的蛋白特异性抗体沉淀交联复合体，再经过蛋白质与DNA解除偶联，纯化目的片段
2、并检测。,ChIP技术的步骤,(1)细胞固定:在活细胞状态下，用甲醒固定蛋白质 DNA复合物，甲醒能有效地使体内的蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA产生交联。 其中使用甲醛作为交联剂的关键优势在于甲醒交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中分别对DNA和蛋白质进行分析。也可以使用紫外光作为交联剂来固定细胞，它比化学交联剂产生更少的干扰，但难以广泛应用。,(2)化学(微球菌酶)或者超声破碎断裂染色质:通常采用超声波打断染色质，使其成一定大小的片段。目前一般认为500-1000bp的大小范围是比较合适的。(3)染色质的免疫沉淀z利用目的蛋白质特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA蛋白质抗体
3、复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段;抗体的量要进行优化，防止非特异的结合，同时要设立相应的阴性对照，以验证抗体的有效性和抗原抗体反应的特异性。,ChIP技术的步骤,ChIP技术的步骤,(4)解除交联和纯化DNA:在免疫沉淀复合体中加入不含DNase的RNase和蛋白酶K(也可以不加蛋白酶K.解除交联后回收DNA.蛋白还可用于做进一步的分析). 65保温6小时使交联解除，得到DNA.并进行DNA的纯化。(5) DNA的检测:可以采用PCR、Southern杂交、ChIP克隆、DNA芯片等方法进行DNA的检测。,ChIP on chip,ChIP on chip将ChI
4、P操作与基因芯片技术分析法(chip)相结合，是研究目的蛋白质与基因组中DNA相互作用位点的一种全基因组定位方法。实验步骤为： 用甲醒固定细胞 超声破碎细胞 特异抗体通过免疫沉淀富集与目的蛋白质交联的DNA片段 解交联,ChIP on chip,用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料(Cy5)进行标记;未经免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR扩增，但是用另一种荧光染料(Cy3)标记扩增产物。 将这两组标记的DNA与一张含有全基因序列的DNA芯片进行杂交。 从3次独立的实验获得的免疫沉淀富集的荧光强度与未经免疫沉淀富集的荧光强度的比值用加权平均分析法计算目的蛋白质与芯片中的每一段序列
5、的相对结合度。,ChIP-Seq,ChIP-Seq技术将ChIP与第二代测序技术相结合，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。其原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序；最后将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。,DNA甲基化分析技术,DNA甲基化是表现遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。随着对甲基化研究的不断深入，其检测方法也层
6、出不穷。这些方法针对不同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。,DNA甲基化分析技术,研究方法：甲基化敏感的限制性内切酶法重亚硫酸盐的甲基化分析方法研究目的：基因组整体水平甲基化分析特异性位点的DNA甲基化检测甲基化新位点的寻找,DNA甲基化分析技术,研究方法：甲基化敏感的限制性内切酶法 一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，他们往往只能结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序列则没有结合活性。这种方法不仅可以用来检测某个基因或DNA序列的甲基化状态，而且可以用作整个基因组甲基化状态的筛查。 在这个原理基础上设计的研究方法有： RLGS (r
7、estriction landmark genome scanning，限制性标志物全基因组扫描)、DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差异性甲基化杂交分析)、MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis，甲基化CpG岛扩增子分析),DNA甲基化分析技术,重亚硫酸盐的甲基化分析方法 其原理是：用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理DNA可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨反应，从而转变成尿嘧啶(U),而甲基化的
8、胞嘧啶不能发生脱氨反应，因而仍保留为胞嘧啶。,DNA甲基化分析技术,研究目的：基因组整体水平甲基化分析 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法 将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，测量254nm处的吸收峰值，计算内/ (5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中CpG位点甲基化的情况。但存在的问题是不能对甲基化的CpG位点进行定位。 免疫化学法 此方法基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应的原理。应用荧光素 标记抗体使之与预先己固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合
9、，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。 这种方法较为灵敏但需要精密仪器。,DNA甲基化分析技术,Sssi甲基转移酶法 原理：S-腺昔甲硫氨酸(SAM)在Sssi甲基转移 酶催化作用下使基因组DNA的CpG位点发生甲基化，在体系中加人一定量的3H-S-腺苦甲硫氨酸(3H-SAM)及Sssi甲基转移酶反应后，测定剩余的放射性标记的S灿4即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。这种方法的缺点是Sssi甲基转移酶不稳定，结果不够精确，另外这种方法也是对DNA的整体CpG位点的甲基化情况检测，不能精确定位。,DNA甲基化
10、分析技术,氯乙醛法 首先，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞唔院全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变(Frommer et ai， 1992)，然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC的水平成正比。这种方法可以直接测定基因组整体5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。,DNA甲基化分析技术,特异性位点的DNA甲基化检测 甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymor
11、phism， MSAP) 实验原理:由于Hpall和MsI的识别序列相同(5-CCGG-3)，但对甲基化的程度不同，即Hpall不能切割双链甲基化的5mCCGG， C5mCGG和5mC5mCGG，但能切基化的序列，而MsI能切割C5mCGG但不能切害5mCCGG序列，因此CCGG发生甲EcoRI/Hall和EcoRI/MsI的酶切、扩增产物产生多态性。通过比较电泳谱带的差异，可以推测CCGG的甲基化情况。,DNA甲基化分析技术,重亚硫酸盐直接测序法 原理：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，之后进行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶
12、，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生申基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。,DNA甲基化分析技术,甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR) 其基本原理是用重亚硫酸氢纳处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性引物对所测基因的同一核昔酸序列进行扩增。此原理的关键在于3对特异引物的设计。,DNA甲基化分析技术,甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(methylation-sensitive sing
13、le nucleotide primer extension，Ms-SnuPE) 原理是：先将研究序列用重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms-SnuPE单核昔酸引物延伸的模板。设计用于Ms-SnuPE延伸的引物的3端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加人等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端；若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。未端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C/T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从
14、而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。,DNA甲基化分析技术,结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA) DNA 样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增，扩增产物纯化后用限制性内切酶（BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG， BstUI能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG， BstU I识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。,DNA甲基化分析技术
15、,甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis， MS-SSCA) 原理:先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核昔酸区设计引物进行 PCR扩增，扩增产物变性后进行非变性的聚丙酷胶凝胶电泳，由于DNA电泳时的迁移率取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酷胶膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后进行单链构象多态性加以分析。,DNA甲基化分析技术,甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(methylation-specific
16、 denaturing gradient gel electrophoresis， M5-DGGE)原理：DGGE是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA片段分离开来的电泳技术。在由低到高的变性梯度胶中，双链DNA片断依据其序列的特异变性点溶化解链，单独的序列将在各自具特征的变性点开始解链。当双链DNA片段迁移到变性凝肢的一定位置，达到解链浓度时，开始部分解链，当迁移阻力与电场力平衡时， DNA片段在凝胶中基本上停止了迁移，这样不同序列的DNA片段就被DGGE有效分离。,DNA甲基化分析技术,甲基化敏感性解链曲线分析( methylation-specific
17、melting curve analysis， M5-MCA) 将 DNA经重亚硫酸盐处理后用荧光素标记然后与Lightcycle联用检测DNA序列甲基化的方法，根据检测到的荧光度对应的 解链温度，判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcyc1e过程中，随着温度升高，逐渐达到DNA双链各解链区域的解链温度(T)， DNA呈区域性 逐渐解链，一般说来，序列中GC含量越高，对应的解链温度越高。,DNA甲基化分析技术,荧光法（Methylight) 原理: DNA样本先用重亚硫酸盐处理，设计一个能与待测位点互补的探针，探针的5端连接报告荧光， 3端连接猝灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针
18、能够与DNA杂交，则PCR过程中在引物延伸时， TaqDNA聚合酶5到3端 的外切酶活性会将探针序列上5端的报告荧光切下，猝灭荧光不能再对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平;同理，若标记的探针未能与DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，报告荧光不被切下，不发光。,DNA甲基化分析技术,甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay， M5-DBA) 过程:待测DNA样本经重亚硫酸盐处理后，以非CG区的引物进行PCR扩增，扩增产物经变性后转移到尼龙膜上平用3端DIG标记的含有2个CG(
19、或TG)的政核昔酸探针与DNA杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交的标本含有甲基化，而与TG探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。,DNA甲基化分析技术,DNA甲基化微阵列法差式甲基化杂交(differential methylation hybridization，DMH)技术 对整个基因组范围内高甲基化CpG岛(CpG islands， CGIs)特异性筛选应用了基于甲基化敏感限制酶(methylation sensitive restriction enzymes， MERS)酶切和连接子PCR(linker-PCR)技术的差
20、式甲基化杂交（DHM）技术。 DMH可选择性扩增和双色荧光标记肿瘤细胞和正常细胞的甲基化CpG岛，根据其混合物与CGIs微阵列杂交荧光信号的变化而获得肿瘤细胞Is甲基化谱。,DNA甲基化分析技术,甲基化特异性寡核昔酸(methylation specific oligonuleotide， MSO)微阵列MSO对每一个被检测基因，预先设计一对含有2个不相邻的GC(或AC)的探针，分别用于识别甲基化和非甲基化的序列。其中含GC的探针(5-GC-GC-3)识别甲基化序列，含AC的探针(5-AC-AC-3)识别非甲基化序列，探针的5端通过linker固定于玻璃板上。首先DNA样本经重亚硫酸盐处理，将
21、非甲基化的胞喃睫变为尿略睫，甲基化的不变，再行PCR扩增，产物的3端用荧光素标记，移至连有探针的玻璃板上进行杂交，通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序列中甲基化的水平。,DNA甲基化分析技术,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry， MALDi-TOF-MS)其基本过程如下:基因组DNA经重亚硫酸氢盐修饰后用一条含T7启动子的引物和一条C含量较高的引物进行PCR扩增，则扩增出的PCR产物带有T7启动子标签和一段富含C的控制标签，由于含有T7启动子，随
22、后将上述PCR产物进行体外转录成RNA，RNA经RNaseTl酶切后用MALDi-TOF检测。,DNA甲基化分析技术,甲基化新位点的寻找 限制性标记基因组扫描(restriction landmark genomic scanning， RLGS)RLGS的基本过程:先用甲基化敏感的限制性内切酶Not I消化基因组DNA，由于Not I识别GCGGCCGC序列，并且可以被重叠的CpG甲基化阻断，因而可以使得CpG岛的甲基化位点被保留，然后用同位素进行末端标记，再经甲基化不敏感的酶如EcoR V进行切割，进行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶如HinfI切割，进行二维电泳，这样甲基化
23、的部分被切割开关在电泳时显示出条带，得到RLGS图谱与正常对照比较，得出缺失条带即为申基化的可能部位。,DNA甲基化分析技术,MBD(methyl-CpG binding domain column chromatography，甲基化结合区)MBD柱中含有甲基化位点特异性结合蛋白的功能区，能够与甲基化位点特异性结合。该蛋白一端通过连接多个组蛋白与凝胶结合，其另一端的多肤功能区暴露，这样当待测DNA片段通过时，含有甲基化位点的DNA即与MBD多肤牢固结合。相同长度的DNA片段中甲基化位点密度越高，其结合力就越强。,DNA甲基化分析技术,联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD柱层析法(combination of methylated- DNA precipitation and methylation-sensitive restriction enzymes， COMPARE-MS) 其过程是：用非待测区的内切酶和甲基化敏感的限制性内切酶同时消化DNA片段，随后通过MBD柱捕获，保留了含有甲基化区的片段，最后通过实时定量PCR扩增定量分析。联合甲基化敏感性限制性内切酶的MBD将MBD柱层析法与MS-RE联用，互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感的检测DNA甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的依据。,
