1、生物化学实验,海南大学海洋学院水产学系,实验室规则(一),、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退，更不得缺席。、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因，经老师同意后，方可换领。并应按规定赔偿或处理。贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作，发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。,实验室规则（二）,、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。、注意安全，用吸量管吸取试剂时应使用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀的试剂更应
2、注意，应避免其直接接触人体及衣物。乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。,实验室规则（三）,、注意实验室卫生、整洁。废弃液体应倒入水槽，放水冲走，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水槽。实验结束后应将实验台整理好。并清扫、整理实验室。关好水、电、门、窗，经老师检查同意后，方可离开实验室。,实 验 目 录,糖的颜色反应 氨基酸的纸层析 血清蛋白的醋酸薄膜电泳 脂肪酸酸价和碘价的测定 DNA的提取与定性实验 过氧化氢酶和过氧化物酶的作用,实验参考书,生物化学实验，陶均辉等编，科学出版社，第三版； 基础生物化学实验，王秀奇等编，高等教育出版社
3、，第二版； 动物生物化学实验指导，周顺伍主编，中国农业出版社，第二版。,实验一 糖的颜色反应,实验安排实验原理实验试剂实验步骤思考题,To Index,实验原理：,莫氏反应：糖经无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与1-萘酚生成紫色的缩合物，可用于鉴定糖的存在。 塞氏反应：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色，可用于鉴定酮糖的存在。 杜氏反应：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚作用生成桃红色物质，可用于鉴定戊糖的存在。,实验安排： 2课时，单人单组,实验试剂： Molish（莫氏）试剂：取5g -萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临
4、用前配制，棕色瓶保存； Sediwanoff（塞氏）试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2OHCl=21）(V/V)中，临用前配制； 杜氏试剂：称取2g间苯三酚，溶于250mL95%乙醇中。临用时取此液3mL，缓缓加入15mL浓盐酸及9mL蒸馏水，临用时配制。,实验步骤：,莫氏反应（按下表加试剂）,注意: (1) 莫氏试剂直接加入溶液中，不能滴在试管壁上！(2) 加浓硫酸时，试管倾斜，硫酸缓缓加入，不要振动溶液！,塞氏反应(按下表加试剂),注意：加热时间要长，观察颜色变化及变化的顺序。颜色变化顺序用1、2、3标记，深浅用+、+、+等表示。,杜氏反应(按下表加入试剂),注意：观察颜色变化及变
5、化时间。,思考题,莫氏反应中莫氏试剂为什么要直接加入溶液中，不能滴在试管壁上? 加浓硫酸时，试管倾斜，硫酸缓缓加入，为什么不能振动溶液？,重点与难点：氨基酸纸层析的基本原理的理解是本实验的难点。重点是掌握氨基酸纸层析的操作方法和运用。 实验安排：4课时，每人独立实验，4人一个层析缸。,实验二 氨基酸的纸层析,To Index,实验原理,纸作支持物，特点是-OH多，亲水性强。 溶剂系统分成两相：固定相（水）特点是易与-OH结合移动慢。移动相（水饱和的有机溶剂）特点是移动速度快。 不同的氨基酸在不同的相中溶解度不同，不同的氨基酸在不同的相中移动速度不同，不同的氨基酸在相同的相中移动速度也不同。 基
6、于以上三点原因，经过层析后，不同的氨基酸移动的距离不同，从而得到分离。分离度用Rf值表示如下：Rf=原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿 的距离,试剂与器材： 氨基酸液（5种）、正丁醇、冰醋酸、水、茚三酮、层析滤纸、层析缸、吹风机、喷瓶、铅笔、直尺、分液漏斗,各式各样的喷瓶,层析缸,实验步骤,实验准备 点样 展层 显色 记录 计算Rf 值 结论,实验准备,层析液配制: 正丁醇:冰醋酸:水= 5:3:2 (体积比)置分液漏斗中静置分层，取上清液约60ml 倒于层析缸中静置到液面不动为止。 滤纸准备：取层析滤纸，裁成1015cm的长方形，在距纸一端1.5cm处用铅笔画一直线。在线的两端距边沿1
7、cm处各划一点。在这两点之间均匀的画上四点。在这六点处标上序号1、2、3、4、5、6。,点样:,用毛细管分别吸取各种样液，分别在各原点点上一种氨基酸。注意每一管要分次点完。样点直径小于0.3cm。,展层：,在层析缸上口处中央，平行的贴上透明胶纸，胶纸要绷紧。在点了样品的滤纸上端中点处垂直贴上透明胶，将滤纸上的透明胶贴在缸口的透明胶上。注意：滤纸点样端朝下，刚好接触缸底，垂直悬于缸中。当溶剂前沿展到距滤纸上端约1.0cm时取出滤纸，用吹风机吹干。,显色：,喷瓶将茚三酮溶液均匀的喷在滤纸上。在约105的条件下烘烤至各层析斑点显色为止。,记录：,将滤纸适当缩小后，将结果画于报告上。,计算Rf值：,在
8、计算Rf 值时，用下标表示氨基酸的名称，最好用每种氨基酸的第一个字标记。例如甘氨酸得Rf值用Rf甘= 表示。,结论：,提示通过主要比较Rf值的差异，讨论在该条件下各种氨基酸分离度的大小。,思考题与习题有哪些因素影响氨基酸的Rf值？,实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳,重点与难点：电泳的基本原理，醋酸薄膜电泳的操作。 实验安排：2课时，6-8人一个电泳槽，每人独立实验。,To Index,实验原理：,带电颗粒在电场的作用下，移动速度计算如下：据此公式，在同一电场强度和缓冲液条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量和自身分子的大小。,器材：,鸡血清蛋白、PH8.6巴比妥-巴比
9、妥钠缓冲液、染色液、漂洗液、透明液、培养皿、 镊子、点样器、剪刀、卧式电泳槽、电泳仪。,主要仪器,水平电泳仪,培 养 皿,实验步骤：,准备和点样 取一条大小为2cm8cm的醋酸纤维薄膜（可根据需要选择薄膜的大小），浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，薄膜再放一张干净滤纸，吸取多余的缓冲液。 用玻棒蘸去少量血清，将此血清均匀地涂在载玻片的一端截面上（玻片宽度应小于薄膜），然后轻轻与距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状涂于纤维膜上。待血清透入膜内，移去载玻片，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的滤纸上，点样端阴极。,电泳：接通电源，
10、电泳条件：电压90110，电流0.4-0.6 Ma/cm ,通电时间约分钟。,染色：电泳完后，将薄膜浸于染色液中分钟，取出用漂洗液漂洗至背景无色。,漂洗：将漂洗后的薄膜放在透明液中浸泡至透明。,纪录：记下色带的条数及宽度和颜色深浅,结论：带数可知至少有多少中蛋白质，宽度和深浅说明该处蛋白质的浓度,思考题与习题影响电泳的因素有哪些？,课堂安排：共2课时，2人一组。 课前提问： 什么叫脂肪酸的酸败？ 人体必需的不饱和脂肪酸有哪些？ 日常生活中油或含脂高的食品变“哈”，为什么？,实验四 脂肪酸酸价和碘价的测定,To Index,实验原理:,酸价的测定：油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH
11、标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量 。 碘价的测定：在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和间能与碘、溴或氯起加成反应。但碘与脂肪的加成作用缓慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，是产生溴化碘，在与脂肪作用。将一定量的溴化碘与脂肪作用后，测定溴化碘的剩余量，即可求得脂肪的碘价，100g脂肪所能吸收碘的克数称为碘价。,器材与试剂：,菜油、Hanus试剂、15%碘化钾、标准硫代硫酸钠溶液、淀粉液、KOH标准液、中性醇醚混合液、1% 酚酞、 碘瓶、滴定管、电子分析天平、称量瓶、,FA系列电子天平,高型称量瓶,实验步骤：,酸价的测定： 准确称取1-2g油脂于100ml三角瓶中； 加入醇醚混合液50ml ,振
12、瑶溶解至透明，溶液由红色变为无色； 继续用标准KOH溶液滴定至淡红色，1min不退色为终点。记录KOH的用量V。,(1),(2),(3),碘价的测定：,准确称取0.2g的油脂置于碘瓶中，加10ml氯仿作溶剂，加入Hnaus试剂20ml，塞好瓶塞，轻轻摇动，混匀后置暗处30分钟，于另一瓶中加同样试剂，不加脂肪，作空白对照。 30min后，先注15%碘化钾溶液少许于碘瓶口边上，使碘化钾溶液流入瓶内，继续由瓶口边沿加入碘化钾溶液，共20毫升，再加水100毫升混匀。随即用标准硫代硫酸钠溶液滴定。等瓶内液体呈淡黄色时，加1% 淀粉液数滴，继续滴定，近终点时，可加塞振荡，使之于氯仿之碘完全作用，继续滴定至
13、蓝色消失为止。记录标准硫代硫酸钠的用量。同法滴定空白管。,计算：,脂肪的酸价= cv56.1/m 脂肪的碘价=c(B-S)/M0.1269100 说明：B：空白所耗硫代硫酸钠的体积（ml） S: 样品所耗硫代硫酸钠的体积（ml）M ：脂肪的质量 C: 硫代硫酸钠的当量浓度,重点与难点：难点是提取DNA的原理和方法，重点是琼脂糖凝胶电泳的操作方法。 实验原理： DNA要溶于酸性乙醇和10%的氯化钠，用丙酮使其沉淀而分离出来。从花椰菜中提取DNA要注意花椰菜要研磨充分。 琼脂糖凝胶电泳的原理：电荷效应和分子筛效应。,实验五 DNA的提取与凝胶电泳,To Index,实验步骤,DNA的提取： 取花椰
14、菜的花冠5克剪碎置于研钵中，加8毫升的酸性乙醇，再加少量的石英砂研磨成匀浆，在4000r/min的条件下离心20分钟，得上清液，弃沉淀。 在上清液中加入等体积的丙酮，混匀，观察现象。提示：有沉淀生成。 在4000r/min的条件下离心20分钟离心上述浑浊液，得沉淀，即为DNA的粗制品。 将DNA的粗制品溶解于0.5毫升的TBE缓冲液和0.1毫升的溴酚蓝指示剂。,DNA的凝胶电泳： 胶的制备：取0.2克琼脂糖凝胶，加入20毫升的TBE，加热溶解后，冷却到50-60摄氏度，加入Goldview 1ul，混匀后倒入插有16孔梳子的1010的凝胶槽中。待凝胶凝固后小心取出梳子，置于电泳槽中，加入TEB
15、的缓冲液，使液面略高于凝胶面。 加样：用移液器取10ul的DNA样液，小心的注入凝胶孔中。 电泳：接通电泳仪的电源，在电压不超过5V/cm的条件下电泳50分钟。待溴酚蓝指示剂移动到凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 观察现象：在紫外灯254nm下观察有没有DNA显出的黄色的色带，并纪录结果 。,注意事项,待胶完全凝固后，方可取出梳子，且不能破坏胶面； 加样时不能捅破胶孔； 紫外灯照射时间尽量短。,实验六 过氧化物酶和过氧化氢酶的作用,重点与难点： 掌握过氧化氢酶和过氧化物酶的作用，同时了解酶的一些特性。 课堂安排：2课时，1人1组单独实验 主要试剂：2%过氧化氢、1%焦性没食子酸、白菜、猪肝、研
16、钵、试管、吸管、纱布、漏斗、天平、剪刀、水浴锅,To Index,实验原理：,过氧化氢酶能催化过氧化氢分解，产生水及分子氧。过氧化物酶催化过氧化氢释放出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质。例如氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的橙黄色的焦性没食子橙。同时产生二氧化碳。,实验步骤:,实验准备： 肝糜的准备：取2g左右的新鲜猪肝，剪碎，平分成两份，其中一份放在沸水浴中煮10min左右。以备做过氧化氢酶的活性作用。 白菜及白菜梗的提取液：取约1g 白菜叶于沸水浴中煮10min左右。以备做过氧化氢酶的活性作用。另取新鲜白菜梗约5g切成细块，置研钵中，加15ml蒸馏水研磨成匀浆，纱布过滤，滤液分成两份，其中一份煮沸。以备做过氧化物酶活性用。,过氧化氢酶的作用取试管4支，按下表加入试剂。,过氧化物酶的作用 取4支试管，按下表加入试剂,思考题与习题,在过氧化物酶的实验中，出现了气泡，此气泡和过氧化物酶作用时产生的气泡在成分上有何异同？为什么？,End Thanks!,
