1、Tailor chemotherapy instructed by pharmacogenomics & pharmacogenetics : current and future,南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心,目录,1 简述 2 药物效应预测分子 3 药物毒性预测分子 4.全基因组技术的应用 5. 问题与展望,1、简述,当今肿瘤的“标准化疗”：肿瘤解剖部位大肠癌： FCF+Oxa RR46%乳腺癌：FAC TA RR50-60%肺癌： TP GP NP RR20-40%肿瘤有“异质性”: 不同种族、不同个体间化疗有效率化疗毒性率,疗效：目前抗肿瘤药物的应用方法对70%的患者疗效有限。
2、毒性：在美国，由于不能预测药物毒性：每年有500万例药物毒性反应;其中有200万例为严重毒性反应;10万例致死性毒性反应；由此带来的经济损失达76.6千万美元。 评价：有20%-40%的患者有可能接受错误的药物治疗。 如何提高疗效？ 如何减少毒副作用？,人类基因组计划的顺利完成蛋白质组学研究对疾病进行分子学亚分类成为可能成为诊断、预后及选择治疗的基础肿瘤/药物：基因表达谱是指导个体化化疗的基础药物遗传学/药物基因组学,药物遗传学（pharmacogenetics） 研究与药物疗效/毒性相关的个体间DNA序列/基因多态性的差异，药物作用靶点、相关致病基因或药物代谢酶等多个环节的遗传变异。可被当作
3、预测药物疗效或毒性的指标。 药物基因组学 （pharmacogenomics ）将全基因组技术（即基因和蛋白表达数据）用于预测一个患病个体对一个/一组药物的敏感性或抵抗性。,药物遗传学与药物基因组学的区别,当今的“标准化疗”按照解剖部位化疗未来的“个体化疗”药物遗传学/基因组学指导下的化疗2004年ASCO会议预测：5-10年后将进入“个体化疗”时代,2、药物效应预测分子,5-Fu相关药物效应预测分子 铂类相关药物效应预测分子 紫杉类相关药物效应预测分子 健择相关药物效应预测分子 EGFR抑制剂相关药物效应预测分子,5-Fu相关药物效应预测分子-TS mRNA （TS，thymidylate
4、synthase，胸苷酸合成酶）,5-Fu脱氧核苷酸+甲酰四氢叶酸+ TS =稳定的三联体， 抑制TS活性，进而抑制DNA合成。,Lenz et al等人的研究报道：65例胃癌患者采用FP方案化疗，采用胃镜穿刺活检得到的新鲜胃腺癌标本，定量PCR检测TS mRNA水平：TS mRNA水平低者：中位生存期43个月。TS mRNA水平高者：中位生存期06个月。结论： TS mRNA水平低者对5-Fu为基础的化疗敏感。,TS mRNA的高低与化疗有效率、生存期之间的关系在肠癌、肺癌、乳癌中也得到进一步证实；许多研究组认为，在各种恶性肿瘤中，TS的过表达不仅与以5-Fu为基础的化疗抵抗相关，而且与临床
5、预后相关。,争 议：,在一欧洲Nordic trials回顾性研究中，862例肠癌患者接受单独手术治疗/手术+5-Fu辅助化疗， 结果表明：在单独手术组，与高TS水平组相比，低TS水平者有更好的生存（P=0.04）； 在接受术后辅助治疗组，作者认为高TS水平者临床获益较明显。这一结果与通过QPCR法所得到的低TS mRNA水平者化疗有效率高生存期长的结论相矛盾。,争 议：,来自North central cancer treatment Group和Mayo Clinic的研究认为采用ICH方法检测，高TS水平者生存期短。 综合分析若干篇肠癌患者5-Fu化疗有效率与TS水平相关性的文献发现，转
6、移性的肠癌患者肿瘤组织内低表达TS者可从姑息性5-Fu化疗获益；相反，局部进展肠癌患者肿瘤组织内低表达TS者未见明显获益于辅助化疗。,小 结,这些实验结果大多来源于回顾性分析以5-Fu为基础的化疗，因此有必要在前瞻性研究中使用新的联合化疗方案重新进行评估。 TS是5-Fu抵抗相关的一关键酶，对于参加辅助化疗的肠癌患者建议检测TS mRNA水平以证实其作为个体化化疗预测因子的作用。 单独检测TS对预测5-FU是否合适？推荐：联合检测！2004 ASCO,5-Fu相关药物效应预测分子-TSER,TSER:（thymidylate synthase promoter enhancer region，
7、 TS启动子增强区域）TS的调节控制机制相当复杂，涉及转录、翻译及翻译后水平等多个步骤。已有研究表明TSER的基因多态性在一定程度上控制着TS的表达。,TSER由不同拷贝数的28bp三联子重复序列构成，TSER*2R、TSER*3R是最常见的等位基因型。 体外实验证实提高28bp三联子重复序列数目将导致TS基因表达增加，TS酶活性提高。 Pullarkat et al 报道TSER*3R纯合子的TS mRNA水平比TSER*2R纯合子高3.6倍。,新辅助放化疗的肠癌患者TSER遗传表型发现，与3R纯合子相比，携带有2R等位基因的患者病理降期程度相对较高。 在另一项研究中对有肝脏转移的肠癌患者评
8、估其TSER变异水平，发现与2R纯合子相比， 3R纯合子TS表达水平高，化疗缓解率低。,Rosell等分析400例（100例对照，300例肠癌、肺癌、乳腺癌）标本发现：TSER多态性与TS mRNA表达相关，3R纯合子有较高的TS mRNA 表达活性 但是：来自日本的报道认为TS遗传型与TS mRNA表达无明显关系，同时发现TS多态性分布与欧美研究结果不同。这表明种族的不同在很大程度上影响着TS遗传表型。,争 议：,需要指出：有关TS多态性与化疗药物效应之间的研究大多为小样本回顾性分析，因此限制了将其作为一预测指标在临床上的广泛应用； 此外，各实验室采用不同的方法（包括RT-PCR、ICH等）
9、和样本（肿瘤组织和替代性外周组织）来检测TS水平，因此难以直接比较各研究组之间的结果。,小 结：,在一组221例肠癌患者接受辅助5-Fu+CF方案化疗的研究中更加确定了TS多态性的临床价值。2R纯合子和2R/3R杂合子（163/221）有显著临床生存期的提高，而3R纯合子（58/221）无生存获益。 其他研究者也发现在肠癌患者中，2R纯合子其TS表达水平低，对5-Fu为基础的化疗缓解率高。 此外，TS的遗传型与MTX的个体化疗缓解率的不同也有关系。205例MTX治疗的儿童急性淋巴细胞性白血病，3R纯合子纯合子生存率低。,卡培他滨（Xeloda）相关药物效应预测分子,由于肝脏、胃肠组织中DPD活
10、性高，口服5-Fu的生物利用度低。因此，提高药物生物利用度的策略之一是采用前药给药模式-卡培他滨（Xeloda）。 由于卡培他滨具有在高表达胸苷酸磷酸化酶（TP）的肿瘤细胞内释放5-Fu这一特点，使其成为一个很有前景的肿瘤特异性药物。 高表达TP的肿瘤组织能更有效地激活5氟脱氧尿苷为5-Fu。卡培他滨治疗效果可以通过TP、TS、DPD评估。,铂类药物相关药物效应预测分子,ERCC1: excision repair cross-complementing XPD: 又称ERCC2，NER途径中一重要成员 XRCC1: 与单链断裂修复有关的蛋白 GSTP1: 谷胱甘肽-S-转移酶 的亚型之一 X
11、PG: NER途径中一重要成员 NER（nucleotide excision repair，核苷酸减切修复）途径与铂类抵抗有很强的相关性,铂类药物相关药物效应预测分子-ERCC1,56例接受GP方案化疗的NSCLC患者:ERCC1表达6.7 中位生存期5个月6.7 中位生存期15个月 ERCC1水平可作为铂类治疗一独立的预后变量; ERCC1是评价DDP抵抗的的一个关键基因(证据水平为2级 )。,铂类药物相关药物效应预测分子- XPD,对73例接受5-Fu+草酸铂治疗的转移性肠癌患者分析其XPD基因多态性，发现1个SNP导致XPD第751密码子上赖氨酸（Lys）转变为谷氨酰氨（Glu），这一
12、多态性与疗效显著相关； 与Lys/ Glu或Glu / Glu基因型的患者(10%)相比，具有Lys/ Lys基因型患者(24%)获得客观缓解率（P=0.015）; Lys/ Lys基因型患者中位生存期17.4个月Lys/ Glu杂合子 12.8月Glu/ Glu纯合子 3.3个月,铂类药物相关药物效应预测分子- XRCC1,61例接受5-Fu+草酸铂治疗的进展期肠癌，发现XRCC1基因中第399位密码子的一个SNP影响其氨基酸产物为精氨酸（Arg）或谷氨酰氨（Glu）。这一SNPs与治疗效果有明显关系。 73%的缓解者具有Arg/ Arg遗传型66%无反应者具Glu/ Glu或Arg/ Gl
13、u遗传型 结论： XRCC1基因多态性与铂类化疗抵抗相关。,铂类药物相关药物效应预测分子- GSTP1,近来发现GSTP1的一个SNPs与107例接受5-Fu+草酸铂化疗的转移性肠癌患者总体生存率相关。 这一SNPs导致在GSTP1蛋白105位密码子由异亮氨基酸（Iso）转变为缬氨酸（Val），这一氨基酸的替换导致酶活性降低。结果：Val纯合子占10% 中位生存期24.9个月；Val杂合子占42%，中位生存期13.3个月；Iso纯合子占49%，中位生存期 7.9个月；（P0.001）,铂类药物相关药物效应预测分子- XPG,由于铂类药物的广泛应用，尤其是第三代铂类草酸铂在多种实体瘤中的肯定疗效
14、，铂类药物有效性相关的药物遗传学研究也广为研究者热衷。在2004年ASCO会议上有多篇报道强烈提示了药物遗传学/基因组学研究在肿瘤治疗领域的价值。,Vila 等人提取33例接受草酸铂治疗肠癌患者的外周血，分析与DNA修复相关的多种基因SNPs。发现： XPD第751位密码子CA碱基的突变与草酸铂治疗毒性/有效率相关：XPD A/A型-血液学毒性 9% XPD C/C型-血液学毒性44%,XPG第3位密码子CT碱基变异与草酸铂药物有效率相关：XPG C/C型-客观缓解率70%XPG C/T、T/T型-客观缓解率8% 提示：XPD C/C与血液学毒性的发生有关，而XPG C/C可作为接受草酸铂治疗
15、的肠癌患者缓解率、TTP、及生存期的预测指标。,紫杉类相关药物效应预测分子,体外研究表明有多种因素影响紫杉类药物化疗有效率 。目前有一重要假设认为紫杉类抵抗的重要机制是微管蛋白的过度表达。 不论在健康或肿瘤组织中，微管蛋白有几种不同亚型，各有其独特表达模式。在肿瘤细胞中II、III亚型表达水平较高，它们的表达增加与紫杉类药物抵抗有关。,75例NSCLC患者，石蜡包埋穿刺标本，定量PCR分析基因表达：微管蛋白III表达低-Pxl+CBP疗效（PR 55.6%），TTP 6.8月微管蛋白III水平高- Pxl+CBP疗效（PR 9%）， TTP 4.2月 另一篇文献报道了类似结果：在NSCLC和卵
16、巢癌细胞系中I、II、III及IVa表达水平的提高导致对紫杉醇化疗敏感性降低。 最近发现在NIH3T3细胞系中，HER2的过表达导致微管蛋白IV表达水平增加3倍，从而导致转化细胞对紫杉类药物抵抗。,健择相关药物效应预测分子- RRM1 （ribonucleotide reductase M1，核糖核苷酸还原酶M1）,核糖核苷酸还原酶（RR）是DNA合成途径的限速酶，在DNA合成修复途径中发挥重要作用。 它主要催化二磷酸核糖核苷酸转化为二磷酸脱氧核糖核苷酸，由M1、M2两种亚型构成。 M1亚型控制其底物特异性及整体酶活性的开关；M2主要携带与底物转换有关的催化区域。 多篇文献报道RRM1过表达者
17、健择化疗不敏感,最近一项研究对100例NSCLC，采用气管镜活检得到的石蜡包埋标本，实时定量RT-PCR法检测ERCC1、RRM1 mRNA的表达， RRM1与DNA合成、修复及GEM代谢有关；ERCC1与DDP活性有关，二者的表达水平高度相关。 RRM1 mRNA低表达或RRM1 、ERCC1mRNA均低表达者GP 方案显著获益，中位生存期明显延长。RRM1 mRNA低表达组中位生存期13.7个月，高表达组3.6个月。,EGFR（epidermal growth factor receptor）抑制剂药物效应预测分子,EGFR信号通路与多种实体瘤的生长及预后相关； EGFR基因的过表达在肿瘤
18、中普遍存在，其基因的转录起始于富含GC启动子区的多个起始位点。已发现EGFR基因的第一个内含子能调节基因转录，它位于转录增强子附近，包含一具有高度遗传多态性的CA二核苷酸重复序列。,芝加哥大学进行的一项前瞻性研究，入组的所有病人采用推荐的II级erlotonib剂量治疗并收集药物动力学、临床、药物效应学（皮肤穿刺）及遗传型数据。 研究提示，EGFR基因启动子区CA二核苷酸重复序列的遗传多态性影响EGFR抑制剂的药物效应。 已有研究证实，与高加索种群相比，日本人erlotonib治疗有效率较高，而这两个种群有着不同的CA重复序列数目。分子靶向药物也需要个体化治疗？！,3 药物毒性预测分子,5-F
19、u相关毒性预测因子DPD (dihydropyrimide dehydrogenase，二氢嘧啶脱氢酶) CPT-11相关毒性预测因子,5-Fu相关毒性预测因子-DPD,如果说TS代表5-Fu的分子靶点并与5-Fu药物效应相关，那么DPD就是5-Fu代谢的限速酶；在5-Fu代谢中有着重要作用。 体内5-Fu剂量的85%都是通过DPD代谢失活，DPD活性丧失时由于代谢清除途径受损大量活性代谢产物5-FdUMP生成，导致病人发生严重的5-Fu相关毒性反应。,现已发现对5-Fu发生严重毒副作用的患者其DPD基因第1986位发生A到G的转化（等位基因DPYD*2A）导致外显子14缺失，形成无活性的酶，
20、具有这种等位基因型的病人易对5-Fu发生严重毒副作用。,补充：DPYD*2A并不是发生严重5-Fu毒性的唯一机制,CPT-11相关毒性预测因子-UGT1A1,CPT-11是一无活性的前药，需经羟酸酯酶的活化转变为其活性代谢产物SN-38。 SN-38的主要清除途径是通过肝脏UGT1A1的糖基化作用转变为无活性的SN-38G，后者通过尿液、胆汁排出。 CPT-11剂量限制性毒性作用-腹泻、中性粒细胞减少，均与SN-38水平增高有关。,CPT-11代谢简图:,目前关于CPT-11的药物遗传学方面的研究主要集中于由UGT1A1多态性引起的SN38G变化。研究发现UGT1A1的表达是高度可变的，由此引
21、起不同病人间SN-38糖化反应的速率相差最高达50倍。UGT1A1基因启动子区具有一定多态性，其不典型TATA盒区域中包含了5-8个TA重复序列。随着TA重复序列数目的增加，UGT1A1表达下降。,UGT1A1的变异型UGT1A1*28其启动子不典型TATA盒区域包含7个TA重复序列，该变异型与UGT1A1表达下降有关并导致SN-38G水平降低 两篇近来发表的文章表明在CPT-11治疗中，UGT1A1*28等位基因的存在导致活性代谢产物SN-38的显著增加,从而发生腹泻中性粒细胞减少的几率显著增加。 提示：UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与CPT-11相关的严重毒副作用的发生。,4. 全
22、基因组技术的应用,药物效应受多重因素影响。涉及多个基因、环境因子等多个方面。 为科学地把握药物效应，对全基因组进行广泛分析的方法显得尤为重要。 基因芯片（gene chip）技术以其高通量、高度并行性、高度敏感性及微型化、自动化特点在该领域广泛被应用 。,基因芯片主要包括原位合成的寡核苷酸芯片和直接点样的cDNA芯片，后者又称为cDNA微阵列（cDNA microarray）,cDNA microarray流程图,5. 问题与展望,药物遗传学/基因组学研究在近年来取得迅猛发展，为医疗领域带来革命性变化。尽管该领域的相关研究备受瞩目且其实验证据水平高，但在临床应用却处于早期阶段。,问 题,新的分
23、子标志在用于临床前，其预测程度精确到多少才能被临床所接受？这主要依赖于具体的临床需要 检测手段的标准化问题 ？ 待检测分子还不够多。 实验室 临床推广需要涉及实用性、可操作性、社会及伦理等多方面的因素。,展望,最重要的是： 药物基因组学/药物遗传学开启了真正意义上的个体化治疗，这对于常规治疗极为困难的恶性肿瘤尤为重要。,展望,蛋白质组学 随着基因组学中预测药物效应基因的逐步确认，蛋白质组学在相关领域的应用也日益受到重视。蛋白质组学以基因最终产物蛋白质为平台评估药物效应。有很多原因支持这一研究策略：,有些基因突变为沉默突变，与基因产物的功能无关； 一些情况下，某一基因的SNPs数量太多，相比较具体分析每一遗传变异而言，对基因功能查物蛋白质进行分析会更为便捷； 从基因-mRNA-蛋白质构成了遗传信息的流程图，什么情况下有什么样的蛋白不仅决定于基因，还与机体所处的周围环境及机体本身的生理状态有关。并且蛋白质间亦存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接，具有自身特有的活动规律。,谢谢,
