1、D B 1 3 0 2山市地方标准nUJ卜色1月峥曰尸卜Br犷引DB1302/T 189-2005绵羊鲜胚胎移植技术规程2005-11-15发布2005-11-30实施唐山市质量技术监督局发布DB1302/T189-2005月I J舀本标准由唐山市畜牧水产局提出。本标准起草单位：唐山市丰南区畜牧水产局。本标准主要起草人：孟令会、李永周、李久元、侯建民、王秀清、马云昌、董庆武。本标准附录A和附录B为规范性附录。DB1302/ T189-2005绵羊鲜胚胎移植技术规程1范围本标准规定了绵羊鲜胚胎生产中供体羊的选择、超数排卵及配种、手术冲卵技术、胚胎质量鉴定、受体羊的选择和胚胎手术移植技术。本标准适
2、用于绵羊鲜胚胎生产和移植。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标注的条款。凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不使用本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本使用于本标准。NY5148无公害食品肉羊饲养兽药使用准则NY5151无公害食品肉羊饲养管理准则3供体羊的选择3. 1供体羊应符合绵羊的品种特征，系谱清楚，遗传性稳定，生产性能良好。3.2供体羊健康状况良好，体质健壮，无遗传性和传染性疾病。年龄一般为2. 5-7岁，青年羊为12月以上。繁殖机能正常，经产羊没有空胎史。3.
3、3供体羊的饲养管理供体羊在采卵前后应保证良好的饲管条件，不得任意变换草料和管理程序，保持中等以上体膘。供体羊按NY5151 , NY5148的规定进行饲养管理。4供体羊的超数排卯及配种4. 1超数排卵4.1.1超数排卵的季节和发情周期绵羊最适超数排卵季节为当年9月下旬至次年3月下旬。绵养的发情周期为16-17d04.1.2超数排卵方法4.1.2.1供体羊埋植孕酮栓14d (CIDR)，于第8d换孕酮栓（(CIDR)，同时肌注0. 1毫克氯前列烯醇。于第12-14d进行连续3d6次FSH超排注射，每d6: 00-7: 00和18: 00-19: 00,注射时间间隔为12h，递减注射。FSH总剂量
4、为200-300单位只。于第6次注射FSH的同时撤掉孕酮栓（CIDR)，并注射0. 1mg氯前列烯醇或孕马血清（PMSG) 200国际单位。4.1.2.2确定供体羊发情后立即静脉注射促黄体生成素（LH) 75-100单位。注射后2h配种。4.1.3供体羊发情鉴定4.1.3.1时间在第6次注射FSH时即对超排供体羊观察发情。4. 1. 3. 2方法试情公羊扎好试情布，放入母羊群中试情。每30-40只供体羊需1只健康试情公羊，当母羊接受公羊爬跨，站立不动，或母羊围着公羊旋转，并不断摆尾，作为发情的标准。4. 2配种4. 2. 1种公羊的选择种公羊应符合绵羊的品种特征，谱系清楚，遗传性稳定，生产性能
5、优良；健康状况良好，OBI302/ T189- 2005体质健壮，无遗传和传染性疾病；繁殖机能正常。4. 2. 2本交从供体羊接受爬跨进行第一次交配，每8-12h配种1次，直至发情结束。4.2.3人工授精4.2.3. 1操作要求a)采精、精液稀释、输精用的器械严格灭菌、消毒。b)采精前对种公羊外生殖器清洗消毒。c)稀释后的精液温度要保持在25一30的环境中。d)输精前，母羊外阴部必须经过清洗消毒。e)输入的鲜精活力在0. 6以上，每次输精有效精子数不少于3X 10，输精次数不少于2次。f)选择适宜的输精部位。4.2.3.2时间确认发情时立即进行第一次输精，之后每间隔8-12h输精一次，直到发情
6、结束。5手术冲卵技术5. 1主要器材a)手术车；b)剃须刀；c)创布；d)止血纱布；e)剪毛剪；f)手术刀柄；g）手术剪；h)止血钳；i)巾帕钳；J）持针器；k）肠钳（带乳胶管）；1)手术刀片；m)缝合线；n)缝合针；o)镊子；p) 35 mm, 100圆形培养皿；q）套管针；7针头（尖端磨顿）r) 16针头（尖端磨钝）；s)10咖透明硅胶管；t）注射器50mL, 20 mL, lOmL;u)吸胚管；v)羊用冲卵管：w）体视显微镜；5 . 2药品a) 75%酒精、5%碘配、新洁尔灭、生理盐水、液体石蜡、双蒸水；b)青霉素、链霉素、牛血清白蛋白、氯化钠（(NaC1)、磷酸二氢钾（KH2PO4)、
7、磷酸氢二钠（Na2HPO怪）、氯化钾（KC1) oDB1302/T189-20055. 3试液的配制5.3. 1磷酸缓冲盐水（PBS)称取NaCl 8. Og, KH2PO4 0. 2g, Na2HPO4 2. 13g, KC1 0. 2g，加双蒸水1000毗，完全溶解后加适量的3M NaOH调pH为7.4，即为PBS液。5.3.2冲卵液量取配置好的PBS液1000毗，加入牛血清白蛋白4g，充分摇匀即成。5. 4冲卵步骤5.4. 1手术5.4.1.1术前准备手术前24h停止饲喂草料，限量饮水，手术器械在使用前用0.5%新洁尔灭液浸泡0. 5h;严格按外科手术要求进行自身消毒，术者分工要明确。5
8、.4.1.2保定与麻醉将母羊仰卧保定，麻醉。5.4. 1.3手术部位在离乳房前端约2cm处，腹中线的两侧均可。5.4.1.4术部剪毛剪毛范围约20cm X 20cm。用肥皂水清洗手术部位，同时剃净毛茬，再用清水洗净。5.4. 1.5术部消毒手术部位按外科手术要求常规消毒，盖上术巾。5.4. 1.6避开血管，用手术刀于术部纵向切开6 cm-8 cm长的刀口，将皮下结缔组织分离，暴露肌膜。用手术刀将肌膜轻轻切开，暴露肌肉层，再用刀柄后端将肌肉层钝性剥离，剪开腹膜。在骨盆腔，膀胱周围触摸子宫角并轻轻地将子宫角引出切口外。5.4.2输卵管冲胚5.4.2. 1冲胚时间在超排母羊发情后2-3d从输卵管采集
9、2-8细胞胚胎，进行鲜胚移植。5.4.2.2方法用7针头从子宫输卵管接合部的子宫端导入到输卵管峡部，将喇叭口导卵管从输卵管喇叭口插入2，一3二，导卵管远端与100 mm培养皿相接，助手事先用lOmL注射器抽取5 mL-10毗37冲卵液，与7针头相接，把冲卵液缓缓推入输卵管，胚胎即随同冲卵液自输卵管回收到培养皿中，另一侧输卵管冲胚操作方法同上。输卵管法的优点是卵的回收率高，冲卵液用量少，检卵省时间。缺点是容易造成输卵管特别是伞部的粘连。目前己很少用此方法。5.4.3子宫冲胚5.4.3. 1冲胚时间在超排母羊发情后6-7. 5do5.4.3. 2方法用止血钳在子宫体处扎孔，向子宫角方向插入羊用羊用
10、冲卵管，当确认以在宫腔内进退畅通时，用注射器向气球注入气体3-5毫升，使其堵塞子宫角，冲卵管另一端与100 mm培养皿相连。用套管针从子宫角尖端插入，把预热的冲卵液缓缓注入子宫腔，每侧子宫角需要25mL-30mL冲卵液，冲完后气球放气，冲卵管插入另一侧，另一侧子宫角操作方法同上。5.4. 4术后处理5.4.4.1冲胚完毕后，用25一30的生理盐水将内脏冲洗干净：将25一30的灭菌液体石蜡5mL-lOmL注入腹腔，以防粘连。DB1302/T189-20055.4.4. 2供体母羊创口采用三层缝合法。即腹膜、肌肉连续缝合；皮肤结节缝合，针脚间距1 cm。在肌肉与皮肤间撒适量青、链霉素粉，以防创口感
11、染。5.4.4.3术后3-5d注射青霉素和链霉素，每d2次。6胚胎质量鉴定6. 1检胚6. 1. 1方法将收集的冲胚液，在放大100-200倍的体视显微镜下检胚，将检出的胚胎放入盛有保存液的35 mm培养皿中。6. 1. 2胚胎类型超排母羊发情后2-3d用输卵管冲胚法采集2细胞、4细胞、8细胞及少数16细胞胚胎。上述发育期按国际胚胎移植协会规定的数码均表示为2。超排母羊发情后6-7. 5d用子宫冲胚法采集胚胎，将胚胎分为桑椹胚（M)、致密桑椹胚(CM)、早期囊胚（(EB),囊胚（(B)o上述发育期按国际胚胎移植协会规定的数码分别表示为3, 4, 5, 606. 2胚胎的质量鉴定6.2. 1胚胎
12、发育特征6.2.1.1桑椹胚（M)能观察到球状细胞团，分不清分裂球，形似桑椹，占据透明带内腔的大部分。6.2.1.2致密桑椹胚（CM)细胞团变小，占透明带内腔的60%-70%06.2.1.3早期囊胚（EB)细胞的一部分出现发亮的胚泡腔，呈指纹状，发暗的内细胞团和亮而透明并包围囊腔的滋养层细胞。细胞团占透明带内腔的70%-80%，难以分清内细胞团和滋养层。6.2. 1.4囊胚（B)内细胞团和滋养层界限清晰并收集于一极，囊胚进一步扩大，胚泡腔明显，细胞充满透明带内腔。6.2.2胚胎分级6.2.2. 1处于发育期2细胞的胚胎：卵裂球轮廓清楚，球体饱满，透明度适中，数目吻合即可定为1级；1/3卵裂球死
13、亡可定为2级；1/2卵裂球死亡可定为3级；其余为4级。I级、2级和3级为可用胚胎，4级胚胎无利用价值。6.2.2.2.1 1级胚胎：胚胎发育阶段与胚龄一致。胚胎形态完整，轮廓清晰呈球形，分裂球大小均匀，胚细胞结构紧凑，透明度好，无附着细胞和泡液。6.2.2.2.2 2级胚胎：胚胎发育阶段和胚龄基本一致。胚胎轮廓清晰，色调和细胞密度良好，可见一些附着细胞和泡液，变形细胞约占1O%-3O%6.2.2.2.3 3级胚胎：胚胎发育阶段与胚龄不太一致。胚胎轮廓不清晰，色调较暗，结构较松散，游离细胞和泡液较多，变性细胞占30%-50%no6.2.2.2.4 4级胚胎：未受精卵、16细胞以下的受精卵、有碎片
14、的退化卵、细胞变性等均属4级，不能作为胚移胚胎利用。6. 3记录按照附录A中的要求填写所有内容。7受体羊的选择选择繁殖机能正常，无传染性疾病、健康、膘情适中，年龄在1.5-6岁之间的经产母羊。受体羊统一打号、建档、单独组群、专人管理。8胚胎手术移植技术DB1302/T189-20058. 1受体羊的同期化发情处理8.1.1方法：与供体羊同时进行孕酮栓（(CIDR)的埋植。13-14d取出，在取栓的前一d或当d，肌肉注射孕马血清（PMSG) 400国际单位，48h前后受体羊可表现发情。8. 1. 2供体羊、受体羊同期化发情判定8.1.2.1供体羊、受体羊均采用试情公羊确认发情。8. 1.2.2把
15、供体羊发情之日定为Od，与供体羊同时发情的受体羊定为Oh受体。比供体羊提前12h发情的定为十12h受体，提前24h的定为+24h受体。比供体羊推迟12h发情的受体定为一12h受体，推迟24h的定为一24h受体。8.1.2.3胚移植时Oh受体，土12h受体移植效果无显著差异。如果受体缺乏，可使用土24h受体。超过+24h的受体不再使用。8. 2胚胎移植技术8.2. 1受体移植所需器械a)体氏显微镜；b)手术车；c)剃须刀；d)剪毛剪；e)手术刀柄；f)止血钳；g）巾帕钳；h)持针器；i)手术刀片；3)缝合针；k)缝合线；1)创布；M)止血纱布；n) 16针头（尖端磨钝）；o) 35 mm培养皿；
16、P）卡介苗注射器；9）针头式细菌滤器；r) 5mL一次性注射器；u)移植管8.2.2受体移植所需药品75酒精、5%碘酊、新洁尔灭、生理盐水、液体石蜡、青霉素、链霉素。8.2.3受体移植操作步骤8.2.3. 1受体母羊的手术法移植技术8.2.3. 1. 1手术过程同5.4. 108.2.3.1.2胚胎的移植部位：与供体母羊冲胚部位一致。输卵管胚在输卵管位置，子宫胚在子宫移植。8.2.3.2吸取胚胎用移植器先吸一段1 cm长的保存液，再吸一段0. 5 c。的空气，然后吸取胚胎。含胚胎的液柱不超过1. 5 cm.8.2.3.3输卵管移植将具有黄体一侧的输卵管伞部拨开，找到管口，把装有胚胎的移植器从此
17、插入3-4 cm,DB1302/T189-2005然后将胚胎轻轻推入输卵管即可。8.2.3.4子宫移植将具有黄体一侧的子宫角取出，用尖端磨顿的16针头在子宫壁上扎一孔，把装有胚胎的移植器从此孔插入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推入即可。8.2.3.5术后处理操作步骤同5.4.48.2.3.6记录按附录B做好受体移植记录。DB1302/ T189-2005附录人（规范性附录）供体羊采胚记录A.1供体羊采胚后应按照表A. 1做好记录表A. 1供体羊采胚记录畜主供体羊耳号与配公羊或冷冻精液来源本交或人工授精日期和次数第一次第二次耳号第三次采胚时间黄体数胚胎类型及质量采集胚胎总数桑椹胚囊胚2细胞胚4细胞胚8细胞胚退化胚数数最分级数最分级M I分级数量分级Ol l分级数最备注：（记录超数排卯所用的药物、方法及其他）DB1302/ T189-2005附录B（规范性附录）受体羊移植记录B.1受体羊移植后应按照表B.1做好记录。表B. 1受体羊移植记录编号受体耳号品种及年龄移植地点发情时间移植时间胚龄、质垦、 数量产羔情况备注
