1、1999年中国科学院硕士分子遗传学真题试卷及答案与解析 一、名词解释 1 半保留复制 2 操纵子 (operon) 3 顺反子 (cistron) 4 衰减子 (attenuator) 5 Alu序列 6 微卫星 DNA(microsatellite) 7 C0t1/2 8 Tm值 9 反义 RNA 10 抑制基因 (suppressor) 11 端粒酶 (telomerase) 12 基因芯片 13 BAC文库 14 共抑制现象 (cosuppression) 15 GU.AG规则 二、简答题 16 依赖于 DNA的 DNA聚合酶所催化的反应的忠实性要比依赖于 RNA的 DNA聚合酶所催化的
2、反应的忠实性要高得多。请说明其机理。 17 请说明 EF-G因子在蛋白质生物合成中的作用。 18 请扼要说明 SOS修复系统。 19 何谓条件型突变 ?何谓基因间抑制突变 ?请说明它们在分子遗传学研究中的作用。 20 在研究一个基因的功能及其表达与调控中，通常要对该基因的 5上游序列进行系统的缺失研究。其主要目的是什么 ? 21 请说明细菌的 Tn10转座子 与玉米的 Ac-Ds转座系统的主要异同点。 22 请扼要说明聚合酶链反应 (the polymerase chain reaction， PCR)的基本原理。 1999年中国科学院硕士分子遗传学真题试卷答案与解析 一、名词解释 1 【正确
3、答案】 半保留复制： DNA的复制主要是以半保留形式进行的。实际上Watson和 Wrick提出的 DNA模型已为复制方式奠定了基础，他们认为 DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋和分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个 DNA分子与 原来 DNA分子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条链来自亲代 DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式称为半保留复制。 2 【正确答案】 操纵子 (operon)：是原核生物基因表达和调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子。 B. Lewin在 (Genes中这样定义操纵子
4、 “Operon is a complete unit of bacterial gene expression and regulation, incklding structural genes, regtdator gene(s), and control elements in DNA recognized by regulator gene product(s).” 3 【正确答案】 顺反子 (cistron)：通过顺反测验所确定的遗传单元，大体上相当于一个编码蛋白质的基因。 B. Lewin在 Genes中这样定义顺反子： “Cistron is the genetic unit
5、 defined by the cis/trans test; equivalent to gene in comprising a unit of DNA representing a protein.” 4 【正确答案】 衰减子 (attenuator)：一个受到翻译控制的转录终止子结构。由于翻译作用的影响，衰减子后面的基因或者继续被转录，或者在衰减子处实现转录的终止即产生衰减作用。 5 【正确答案】 Alu序列：在大多数哺乳动物高丰度的短散布重复序列家族中都含有 Alu序列， Alu族序列成员众多，大约有 300 000个。每个长度约 300bp，在其第 170位附近都有 AGCT这样的
6、序列，可以被限制性内切酶 Alu I所切割(AGCT)，故称这些重复序列为 Alu序列。无论从 Alu族序列的长度还是从其重复频率上看， Alu族序列都更像高度重复序列，然而它们不同于高度重复序列的串联集中分布，而是广泛散布在非重复序列之间。 6 【正确答案】 微卫星 DNA(microsatellite)：微卫星 DNA是指以少数几个核苷酸(多数为 2 4个 )为单位多次串联重复的 DNA序列，人们也称之为简单序列重复、短串联重复或简单序列长度多态性。 7 【正确答案】 C0t1/2： DNA复性是一种双分子二级反应，单链消失的速度可用下面公式表示： (-dC/dt=kc2)，其中 C为单链
7、 DNA的浓度，单位是每升的核苷酸摩尔数； t是时间，单位是秒； k是二级反应常数，单位是升 /moL.秒。在初始 t0时，C=C0。上式积分得 C/C0=1/(1+k2C0t)，复性的分数 C/C0是起始浓度和经过时间的乘积 C0t的函数，这样的函数可以绘成图，称为 C0t曲线。反应进行到一半时即C0t=1/2时的 C0t值定义为 C0t1/2，当 C/C0=1/2时， C/C0=1/(1+k2C0t1/2)=1/2，C0t1/2=1/k2。当反应进行到一半时，影响 DNA复性的因素中只有 DNA序列的复杂性 (X)是惟一可变的因素，即进行到一半时的 C0t值，直接与 DNA样品复杂度相关，
8、 X是复性能力的函数。 8 【正确答案】 Tm值：当缓慢而均匀地增加 DNA溶液的温度时，记录各个不同温度下的紫外吸收值 A260，即可绘制成 DNA的熔解曲线。 A260急剧变化的温度范围一般为 6 8 。当 A260增加到最大值的一半时，即相当于 A260值达到约 1.185时，这时的温度叫做 DNA的熔解温度或熔点，用 Tm值表示。 9 【正确答案】 反义 RNA： 1983年， Mizcino和 Simon等人差不多同时发现了反义 RNA对基因表达的调控作用，从而提示了一种新的基因表达调控的机制。反义RNA是指与被调控的 RNA或 DNA序列互补的 RNA，它通过配对碱基之间的氢键作用
9、与特定的 RNA或 DNA形成双链复合物，影响 RNA的正常修饰、翻译等过程，封闭或抑制基因的正常表达，起到调控作用。 10 【正确答案】 抑制基因 (suppressor)：正向突变的无义突变、错义突变和移框突变都可为另一基因上的突变所抑制，这类抑制突变均发生在 tRNA基因或与 tRNA功能有关的基因上，这些基因又称为抑制基因。 11 【正确答案】 端粒酶 (telomerase)： Blackburn等人首先发现四膜虫端粒中存在一种端粒酶，这种酶能够将四膜虫端粒结构中单链尾巴 5TTGGGG3延长，延长的部分仍然是 5TTGGGG3。事实上，各种端粒结构中这一富含 G的序列总是突出12
10、16个核苷酸。这一富含 G的单链尾巴的长度是如何控制的以及这一单链在复制中的功能都还不清楚。这种单链尾巴可能弯转过来作为引物复制 5末端。另一种可能性是某种端粒结合蛋白有可能像腺病毒 pTP那样结合于最末端的单链重复序列，并作为蛋白质引物复制 DNA的 5末端。 12 【正确答案】 基因芯片：所谓基因芯片，是指利用大规模集成电路的手段，控制固相合成成千上万个寡核苷酸探针，并把它们有规律地排列在指甲大小的硅片上，然后将要研究的材料，如 DNA或 cDNA用荧光标记后在芯片上与探针杂交，再通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所需的
11、信息。 13 【正确答案】 BAC文库 (bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体文库 )：以噬菌体为基础构建的载体能装载的外源 DNA片段只有 24kb左右。然而许多基因过于庞大，不能作为单一片段克隆于这些载体中，特别是人类基因组和水稻基因组的工作需要能容纳更长 DNA片段的载体，因此人们组建了一系列的人工染色体。 BAC是人工染色体的一种，是以细菌 F因子 (细菌的性质粒 )为基础组建的细菌克隆体系。 14 【正确答案】 共抑制现象 (cosuppression)：在转基因的研究中，只要转化基因与植物中已有的基因存在序列上的同源性 (包括半同源 )，则
12、转入的基因和内源基因都有可能受到抑制，这种现象称为共抑制。它具有以下特点：共抑制可以发生在转化基因及其同源的内源基因之间，对其他 非同源基因表达不发生影响，即内外源基因间同源顺序的存在是它产生的基础。多拷贝外源基因的导入也发生共抑制。转基因与内源基因经分离重组发生分离之后，共抑制现象消失。共抑制与启动子来源无关。抑制基因在体细胞中的表达抑制是随机发生的，并可逆进入正常的表达状态。共抑制总是出现在植株的分枝点上，或者说，一个分枝长出白色花，另一个长出紫色花。 15 【正确答案】 GUAG 规则：核基因 mRNA内元的拼接点序列很简单，均为 GUAG ，这就是普遍适用的所谓的 GUAG 规则，也称
13、为 Breathnach-chambon规则。 二、简答题 16 【正确答案】 DNA聚合酶的种类很多，它们在细胞 DNA复制过程中起着重要的作用。 DNA聚合酶有 DNA聚合酶 、 、 三类，这些酶的共同特点在于它们都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链 DNA分子引物链的 3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，这些酶作用时需要以 DNA作模板，合成产物的序列与模板互补，所以这些酶又称为依赖于 DNA的 DNA聚合酶。 反转录酶是以 RNA为模板，按 RNA中的核苷酸顺序合成 DNA，是与一般转录过程中遗传信息流从 DNA到 RNA的方向相反，所以又 可称为依赖于 RNA的DNA聚合酶。它最早在
14、致瘤 RNA病毒中首先发现，最普遍使用的则是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶。 依赖于 DNA的 DNA聚合酶所催化的反应的忠实性要比依赖于 RNA的 DNA聚合酶所催化的反应的忠实性要高得多。其主要原因是依赖于 DNA的 DNA聚合酶具有 35外切活性。 35外切活性可以删除引物 3末端错误插入的核苷酸，称为校正阅读。这一功能对于提高 DNA合成的真实性起着重要作用。缺失 35外切活性的大肠杆菌聚合酶 催化 DNA合成时出现错误几率增高 5 50倍。因此 ， 35外切活性可以使 DNA真实性提高 1 2个数量级。 大肠杆菌 DNA聚合酶与 DNA结合可有二种状态：一种是聚合状态，即引物
15、3末端在酶的聚合活性附近；另一种是删辑状态，引物 3末端位于 35外切活性位点，当酶处于删辑状态时，引物 3末端拆开至少 4bp， 3端才能结合到 35外切活性位点。引物 3末端局部融开结合到外切活性位点而被水解。错配对的末端核苷酸更容易融开，即使在 0 也被水解。因此 DNA聚合酶的聚合状态与删辑状态之间的转换是酶与模板一引物相互作用的结果。 Klenow片段的两个结构域 中，大结构域的直径约 2.2 2.4nm的带正电荷的深沟， DNA结合在这个活性部位里并穿过，较小的结构域可能是底物 dNTP结合区域。当 DNA结合到酶深沟内，柔性很大的蛋白质的次结构域就可以合拢起来。 DNA复制时 D
16、NA只能在沟内向前或向后穿滑过去。 DNA模板一引物的 3末端如果含有错配对，末端融化而 DNA外形变形，使它不容易滑过直径 2.2 2.4nm的沟，造成阻塞，延长同 35外切活性的校正接触，将导致错配对碱基切除。 17 【正确答案】 当完整的核糖体在起始密码子形成以后， P位已被携带 (甲酰 )甲硫氨酸 的起始 tRNA所充满，而 A位仍然空着。如果不考虑密码子和反密码子配对的话，则除起始 tRNA之外的任何一种 tRNA都可以进入 A位。然而， tRNA进入 A位不是自发进行的，而是需要延伸因子 EF。延伸因子有三种：一种是热不稳定的，叫做 EF-Tu；一种是热稳定的，叫做 EF-TS；第
17、三种是依赖于 GTP的延伸因子 EF-G，又称转位因子。 EF-Tu首先与 GTP结合，然后与氨酰 tRNA结合形成三元复合物。这样的三元复合物才能够进入核糖体的 A位。其中 GTP的存在是氨酰 tRNA能够进入 A位的先决条件之一，但并不需要 GTP的水解。 一旦进入 A位以后， GTP立即水解成 GDP， EF-Tu、 GDP这个二元复合物就与氨酰 tRNA解离而释放出来。只有这时，肽基转移酶才能把位于 P位的甲酰甲硫氨酰基或肽基转移到 A位的氨酰 tRNA氨基上并形成第一个肽键或新的肽键。这一步的关键是 GTP的水解和 EF-Tu.GDP的释放。 现在已有充足的证据说明 GTP的存在及其
18、水解释放与氨酰 tRNA进入 A位点和肽键形成的关系。人们使用一个不能被水解的 GTP同系物 GMP-PCP，其中 C代表连接 和 磷原子的亚甲基而不是 GTP中的氧原子。利用这种同系物照样能够形成三元复 合物，然后进入 A位，但是肽键不能形成。这就说明三元复合物的形成及其进入 A位点所需的是 GTP的存在而不是它的水解。 GTP水解后， EF-Tu.GDP就不能有效地与氨酰 tRNA结合，这说明鸟嘌呤核苷酸控制着 EF-Tu的分子构象。对于肽键的形成，不但需要 GTP水解，而且需要 EF-Tu.GDP的释放。人们用黄霉素抑制 EF-Tu的功能。当 EF-Tu与黄霉素结合以后，照样能够形成三元
19、复合物并使氨酰 tRNA进入 A位， GTP也照常水解，但 EF-Tu.GDP不能从核糖体释放下来。其继续存在妨碍了肽 -tRNA和氨酰 tRNA之间肽 键的生成。其结果是蛋白质合成停滞不前。 当肽键在 A位上形成之后，也只有在这个时候，转位因子 EF-G和 GTP才能够结合上来。 EF-G与 GTP可能形成很松弛的复合物，也可能二者在肽键形成之后直接结合到核糖体上来。同样，这种结合需要的是 GTP的存在而不是 GTP的水解。因为 GMP-PCP照样能促进这种结合。然后，由核糖体中具有 GTP酶活性的某种蛋白质将 GTP水解，在 A位生成的肽 -tRNA才能转移到 P位，同时将原来 P位上空载
20、的 tRNA逐出核糖体， mRNA也移动了一个密码子。在转位以后， EF-G和 GDP必须释放出 来，下一个氨酰 tRNA的三元复合物才能进入 A位。有一种抗生素叫甾酸霉素能够使核糖体停在转位后的状态。这是因为甾酸霉素稳定了 EF-G.GDP与核糖体的复合物，使下一个氨基酸不能加到肽链上来。 由上可知，只有 EF-Tu离开核糖体以后， EF-G和 GTP才能结合上来。同样，只有 EF-G离开核糖体后，新的氨酰 tRNA三元复合物才能进入 A位。现在还不知道延伸因子互相排斥的现象是否由于这些因子对核糖体上互相重叠的结合位点的竞争而引起的。人们已知一种药物硫链丝菌素能抑制两种延长因子的结合。然而有
21、一点是必需的，那就是 P位点和 A位点的状态。只有当 P位点被肽 -tRNA占据而 A位点空着时，氨酰 tRNA三元复合物才能进入 A位点；只有当肽键生成后，肽基转移到 A位的氨酰 tRNA上， P位 tRNA空载， EF-G和 GTP才能结合到核糖体上来。加上 鸟嘌呤核苷酸控制着这两种延伸因子构象，从而改变了它们对于核糖体的亲和力，使一种因子与核糖体的结合与释放有序地进行。这样，两种延伸因子就能交替地与核糖体发生相互作用，使肽键合成和转位作用有条不紊地进行。 18 【正确答案】 SOS修复是一种旁路系统，它允许新生的 DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜
22、伏的过程。有时尽管合成了一条和亲本一样长的 DNA链，但常常是没有功能的。其原则是：丧失某些信息而活存总比死亡好一些。 SOS修复的机制至今还没有透彻地理解，但据认为是 SOS修复 系统引起校对系统的松懈，以使聚合作用能够向前越过二聚体 (超越二聚体合成 )，而不管二聚体处双螺旋结构的变形。 当 SOS修复系统被活化以后，校对系统就大大地丧失了识别双螺旋结构变形的能力，从而结束了空耗过程，而使复制又继续前进。两个腺嘌呤也加到与二聚体相对的位置上。关于 SOS修复的一些早期的假说认为，在二聚体相对的位置上，可以是任何碱基，因而引起突变。但是新近的研究结果表明，错误的碱基可以出现在生长链上的任何位
23、置，而不一定要在二聚体相对的位置上。由于校对功能的丧失，在新合成的链有比正常情况下多得多的不配对 碱基。尽管这些错配碱基可以被错配修复系统和切除修复系统纠正，但因数量太大，没有被纠正的错配碱基仍然很多。现在看来， SOS修复系统的介入是紫外线诱发突变的主要原因。 SOS系统可能以某种方式对 Pol 进行修饰，如改变某一个负责校对功能的亚基。基因 umuC的产物可能是这个错误潜伏的修复系统的重要组分，因为 umuC的突变使 SOS的诱变作用丧失。 SOS修复 (或许还有重组修复 )与切除修复不同，切除修复系统的酶在正常细胞中就已存在；而 SOS系统的酶只到细胞受到损伤时才出现。这可以从这样的一个
24、实验得到证明：紫外线照 射过的 E. coli比没有照射过的 E. coli更能支持紫外线照射过的 噬菌体的生长。这种现象，叫做 UV复活或者 W复活 (为了纪念这一现象的发现者 Jean Weigle)。这个现象显然牵涉到一种修复过程，而且只有当细胞是recA+时才出现；然而它并不需要 uvr基因。现在认为，这种现象就是因为 SOS系统在起作用，当紫外线照射细菌时， SOS系统就被开启。 SOS修复系统牵涉到几个基因，其中最清楚的是 recA基因和 lexA基因 (即对紫外线抗性基因 )。在正常细胞内， SOS系统是关闭的。生物在长期进化过程中，已经有了优良的校对功能以在复制中保持极高的准确
25、性，因此必须使 SOS这个错误潜伏的复制过程关闭。这个作用是通过 lexA基因产物而实现的。 LexA蛋白是一种阻抑蛋白，结合于 SOS系统中各基因的操作子上，使得这些基因没有活性，很少产生转录产物，从转录水平上控制了这些基因。再说 recA基因，它的产物有三种主要的生物化学活性：一是重组活性；二是单链 DNA结合活性；三是蛋白酶活性。在细胞内， DNA合成正常进行时， RecA蛋白是没有蛋白酶活性的。然而，当DNA合成受到阻碍时，一部分已经存在于细胞中的 RecA蛋白就转变成有活性 的蛋白酶。这种活化作用需要单链 DNA，很可能与 RecA蛋白结合，因为 RecA蛋白有单链 DNA结合活性。
26、 RecA蛋白酶活性仅作用于少数特定的蛋白质， LexA蛋白就是其中之一。 LexA蛋白被水解成两个片段，就不再阻止 SOS的基因的转录，因而就开启了 SOS系统。当修复完成时， DNA合成转入正常， RecA蛋白又推动了蛋白酶活性， LexA蛋白又得以控制 SOS系统的基因的转录，从而使 SOS系统处于关闭状态。 SOS修复只是 SOS反应的一部分。细菌在 UV、丝裂霉素 C、烷化剂等作用下，造成了 DNA的损伤，从而抑制了 DNA的复制。在这种情况下，细胞就会产生一系列的表型变化，包括对损伤 DNA的修复能力迅速增强、诱变率的提高、细胞分裂停止以及 原噬菌体的诱导释放等。这些反应通称为 S
27、OS反应。不单造成 DNA损伤的因素可以引起 SOS反应，其他凡能抑制 DNA复制的因素，如胸腺嘧啶饥饿、加入 DNA复制的抑制剂以及某些重要基因的突变等，均能触发 SOS反应。 19 【正确答案】 从突变表现型对外界环境的敏感性来区分，可分为非条件型突变和条件型突变。突变表现型对外界环境敏感的突变称为条件型突变。 基因组中的任何基因都可以出现条件型突变。 对于非必需基因，我们可以选择条件突变，也可选择非条件突变来研究它们的功能。而对于任何情况下都是必需的基因，任何使之失去活性的突变都必然引起细胞死亡，因而只能通过选择条件突变来研究它们。条件突变体表现为条件致死，即在许可条件下细胞生长正常或近
28、乎正常，而在非许可条件下表现出病态或死亡。生物体任何基因的表达都是依赖于各种各样的体内条件和环境条件的，所以从广义来说，任何突变体都可以看作是条件型的。然而在实际的研究工作中，人们只选择比较容易控制的条件，如温度、必需的营养物质、抗菌素等。对温度敏感突变体的研究最多，因为 通过提高或降低温度，可以很快很方便地关闭或开启某一基因产物的活性。温度敏感突变体已被用来研究基因尤其是必需基因在细胞生存、生长、分化和个体发育中的作用。一般来说，细菌温度敏感突变体的许可温度为 30 左右，非许可温度为 42 左右，也有少数突变体的非许可温度低于许可温度，温度敏感突变一般为错义突变。改变了的蛋白质产物在许可温
29、度下活性正常或接近正常，而在非许可温度下无活性，这可能是由于氨基酸的改变在非许可温度下不能形成高级结构或多亚基复合物。 在有些回复突变中，第二点回复突变并没有改变正向突变的 DNA碱基序列，只 是其突变效应被抑制了。因而第二点回复突变通常称为抑制突变。发生在正向突变基因之中的抑制突变叫做基因内抑制突变，例如由碱基替代引起的错义突变和由插入或缺失一个或几个碱基引起的移框突变，都可以被基因内另一位点的突变所抑制。抑制突变也可发生在其他基因之中，这叫做基因间抑制突变。根据野生表型恢复作用的性质还可以分为直接抑制突变和间接抑制突变。直接抑制突变是通过恢复或部分恢复原来突变基因蛋白质产物的功能而使表现恢
30、复为野生型状态。所有基因内抑制突变的作用都是直接的。一些改变翻译性质的基因间抑制突变的作用也是直接的。间接 抑制突变不恢复正向突变基因的蛋白质产物的功能，而是通过改变其他蛋白质的性质或表达水平而补偿原来突变造成的缺陷，从而使野生型得以恢复。正向突变的无义突变、错义突变和移框突变都可为另一基因上的突变所抑制，这些抑制突变分别称为无义抑制突变、错义抑制突变和移框抑制突变。这类抑制突变均发生在 tRNA基因或与 tRNA功能有关的基因上，这些基因又称为抑制基因。 基因间间接抑制的形式和类别多种多样，凡是能够使某一突变基因产物在一定程度上完成其应有使命的其他基因突变都是基因间间接抑制突变。如果原初突变
31、发生在编码蛋白质的结构基 因中，则造成间接抑制的机制主要有以下几种： 假设两个基因的多肽产物相互作用形成一个有功能的多亚基蛋白质复合体，其中一个基因的突变妨碍了正常相互作用。这时如果另一个基因的突变能够恢复这种相互作用，则后一个突变便是前一个突变的抑制突变。 在某一生化途径 ABC中，负责催化 BC反应步骤的 Y基因发生突变后，该酶仅保存微弱的活性，所产生的 C量太小而不足以使最终的表现型产生。如果催化 AB反应步骤的 X基因产物因结构基因突变 (提高 X的活性 )或基因的调节区域突变 (增加产物 X的浓度 )，则中间产物 B的浓度增加，在突变的 Y基因产物作用下仍然能够产生较多的 C，从而产
32、生应有的表现型。这里， X基因突变就是Y基因突变的抑制突变。 当一个生化途径因突变被阻断时，抑制突变可以使反应绕过被阻断的步骤而补偿第一个突变的效应。例如由最初底物 A产生最终产物D可以通过 两种途径。其中 ABD为主要途径， ACD为活性很低的支路。 ABD途径因突变失活后，细胞不能产生足量的 D，这时，任何提高ACD途径活性的突变都能增加 D的产量，表现抑制效应。 有时一个基因的突变造成某种有害物质的积累，另一基因的突变可以通过提高分解酶的活性或将有害物 质纳入其他生化反应的轨道而消除之。从表现型上，后一个突变也是前一个突变的抑制突变。 综上所述，间接抑制突变基因和它所抑制的突变基因之间在
33、结构上或功能上密切相关。在遗传学研究中，分离鉴定某突变基因的抑制突变体是鉴定各基因产物之间、基因产物与基因之间、基因产物与基因的调控位点之间相互关系的重要手段。 20 【正确答案】 在研究一个基因的功能及其表达与调控中，通常要对该基因的 5上游序列进行系统的缺失研究，其主要目的有以下几个方面： 1在基因的 5上游序列产生缺失，这些突变型的调控元件可与适当的报道基 因相连，于是就可以在转染细胞中定量测定报道基因的表达水平。这类实验常可提供有关启动子与组织特异性增强子的大小及其在调控区中的位置的第一手资料。 2将 DNA区段截短以便进行 DNA测序，进一步分析基因的功能及对应的氨基酸序列。 3利用
34、缺失作图，进行基因精细结构定位，缺失作图时必须具有一组重叠缺失突变系作为工具，把所要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别进行重组测验。凡是能和某一缺失突变进行重组的，它的位置一定不在缺失的范围内，凡是不能重组的，它的位置一定在缺失范围内。 21 【正确答案】 Tn10是一种复合转座子，其大小为 9300bp，所带的抗性基因为抗四环素基因。 Tn10两端的末端重复有 22bp长，但只有最靠外侧的 13bp是转座必需的，改变这段序列的突变使转座作用丧失。这些突变的效应表现为顺式，与它并存于同一细胞中的野生型末端组件不能恢复突变体的转座能力。 Ac-Ds体系的自主转座子 Ac长 4563bp，转录生
35、成单一 RNA；剪接后的 mRNA长 3500bp，并含有 807个密码子的可读框一个，被 4个内含子分隔成 5个外显子。 Ac转座子的两端有 11bp的反向重复序列。在其靶 DNA位点复制形成 8bp正向重复。已知所有 Ds都是 Ac转座子的缺失突变体，如 Ds9只缺失 194bp，而 Ds6缺失了约 2.5kb，非自主性转座子虽然缺失内源序列，但其两端转座特征序列却是完整的，只要细胞内有相应的转座酶活性，它就能恢复转座性能。 Tn10和 Ac-Ds系统的主要相同点为： (1)在转位因子的两端，都存在末端重复序列。 (2)都含有可读框，它可编码转座酶，其功能是促进转位因子的转位。 (3)受体
36、 DNA上都有很短的一段靶序列，由于转位因子的插入，靶序列在转位因子的两侧正向重复序列。 Tn10和 Ac-Ds系统的不同之处在于： (1)Tn10带有抗四环素的抗药性基因，当其转入宿主细胞后，可使宿主细胞具有抗药性。 (2)Ac-Ds系统由自主性因子 Ac和非自主性因子 Ds组成。 Ac具有自主剪接和转座的功能， Ds单独存在时是稳定的，不能转座。 22 【正确答案】 PCR技术是美国 Cetus公司人类遗传研究室的科学家 K. B. Mtdlis于 1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的
37、目的基因或某 一特定的 DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的 DNA拷贝，所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。 PCR技术快速敏感，简单易行，其原理并不复杂，与细胞内发生的 DNA复制过程十分类似。首先是双链 DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的 DNA分子，然后 DNA聚合酶以单链 DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸 (dNTP)合成新生的 DNA互补链。此外， DNA聚合酶同样需要有一小段双链 DNA来启动 (“引导 ”)新链的合成。因此，新合成 的 DNA链的起点，事实上是由加入在反应混合物中的一
38、对寡核苷酸引物在模板 DNA链两端的退火位点决定的。这是 PCR的第一个特点，即它能够指导特定 DNA序列的合成。 在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下，两条单链 DNA都可作为合成新生互补链的模板。由于在 PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始，并沿着相反链延伸。这样，在每一条新合成的 DNA链上都具有新的引物结合位点。然后反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开，并加入 下轮的反应循环，即引物杂交、 DNA合成和链的分离。 PCR反应的最后结果是，经几次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA分子数，即两条引物结合位点之间的 DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是 2n。这就是 PCR技术的第二个特点，即使特定的 DNA区段得到了迅速大量的扩增。
