1、 1 印行年月 94 年 10 月 本標準非經本局同意不得翻印 中華民國國家標準 CNS 總號 類號 ICS 11.040.01 T5013-514393-5經濟部標準檢驗局印行 公布日期 修訂公布日期 93 年 4 月 20 日 年月日 (共 8 頁 )醫療器材生物性評估 第五部分：體外細胞毒性試驗 Biological evaluation of medical devices Part 5： Tests for in vitro cytotoxicity 1. 適用範圍 本標準規定評估醫療器材體外細胞毒性之試驗方法。 這些方法指明細胞培養是直接或透過擴散作用 (1) 與器材之萃取物，和
2、(或 ) (2) 與器材接觸。 這些方法是用適當之生物參數檢測哺乳類細胞體外之生物反應。 2. 用語釋義 本標準之用語除依據 CNS 14393-1醫療器材生物性評估 -第一部分：評估與試驗所規定者外，另作定義如下。 2.1 陰性對照材料 依本標準之方法試驗時不會產生細胞毒性反應的材料。 備考： 陰性對照的目的是用來表示背景反應。例如，合成高分子材料之高密度聚乙烯 (1)，以及牙科材料之氧化 鋁陶瓷棒等均已是採用之陰性對照材料。 2.2 陽性對照材料 依本標準之方法試驗時具有再現性之細胞毒性反應的材料。 備考： 陽性對照的目的是用來表示適當的試驗系統反應。例如，使用有機錫作安定劑之聚氯乙烯 (
3、2)已經被採用 為對固體材料與萃取物之陽性對照材料而如酚之稀釋液已經被採用為對萃取物之陽性對照材料。 2.3 試劑對照組 經相同萃取條件與試驗步驟，不含試驗材料之萃取溶媒。 備考：在本標準中，此定義取代 ISO 10993-12： 1996，第 3.1 節之用語釋義。 註 (1) 高密度聚乙烯可以從美國藥典與食品藥物安全中心取得。 這些信息的提供只是為了本標準採用者之方便，國家標準並不為這些產品背書。 (2) 使用有機錫作安定劑之聚氯乙烯的陽性對照材料可自 SIMS Portex 公司取得， ZDEC 與 ZDBC 聚銨酯 可以從美國食品藥物安全中心獲得。這些信息的提供只是為了本標準採用者之方
4、便， 國家標準並不為這些產品背書。 2.4 培養器皿 適合細胞培養之培養器皿，包括玻璃培養器皿、塑膠培養瓶或塑膠多孔培養盤 2 CNS 14393-5, T 5013-5 與微量滴定平板。 備考：這些培養器皿如果符合組織培養等級與適合應用於哺乳類細胞，則 在這些方法中可以相互替代使用。 2.5 次群集 約 80 %之群集，即生長對數期的終點。 3. 樣品製備 3.1 通則 這些試驗須針對下列情況之一執行 (1) 材料的萃取物和 (或 ) (2) 材料的本身。 樣品須依 ISO 10993-12 製備。 3.2 材料萃取液之製備 3.2.1 萃取原則 萃取條件應試著模擬臨床應用條件或加以放大，以
5、決 定可能之毒性的危害，而不可造成試驗材料顯著的變化，如融合、熔化或化學結構的改變。 備考： 在萃取物中之任何內生的或外來的材料濃度，其所導致對試驗細胞的曝露劑量，依界面面積、萃取液體積、 pH、化學溶解度、擴散速率、滲透壓、攪動、溫度、時間與其他因素而定。 3.2.2 萃取溶媒 對哺乳類細胞進行檢測時，須 使用下列單一或多種溶劑，萃取溶媒的選擇須經判斷： (1) 含血清培養基 ; (2) 不含血清培養基 ; (3) 生理食鹽水 ; (4) 其他合適之溶劑。 備考： 溶劑的選擇應能反應萃取 的目的，並須考慮使用極性與非極性溶劑。合適的溶劑包括純水、植物油、二甲碸，濃度超過 0.5%之二甲碸對所
6、選擇的檢測系統具有細胞毒性。 3.2.3 萃取條件 3.2.3.1 萃取須在無菌及無化學活性的密閉容器以無菌的技術進行之，一般依ISO 10993-12 之規定。 3.2.3.2 建議的萃取條件為： (1) 在 (372) 下，萃取不少於 24 h (2) 在 (502) 下，萃取 (722) h； (3) 在 (702) 下，萃取 (242) h； (4) 在 (1212) 下，萃取 (10.2) h。 這些建議的萃 取條件可以依據器材的特性與使用的特殊狀況加以應用。 3 CNS 14393-5, T 5013-5 利用含血清培養基的萃取步驟僅能適用於第 3.2.3.2.(1)節的條件。 3
7、.2.3.3 如果萃取物在應用到細胞之前，先過濾、 離心或其他方法加以處理，這些須於最終報告加以載明 (參見第 8 節 )。對萃取物進行之任何 pH值的調整須加以記錄，對萃取物的處理，如 pH 值的調整可能會影響結果。 3.3 進行直接接觸試驗之材料製備 3.3.1 在細胞毒性分析時， 具有不同形狀，大小或物理狀態 (如液態或固態 )的材料可以不必改變就用來試驗。 固態樣本的較佳樣品須至少有一平坦的表面。 對於其他形狀與物理狀態須作某些調整。 3.3.2 須考慮試驗樣本的無菌性。 3.3.2.1 從無菌器材取得的試驗材料須在試驗全程中以無菌處理。 3.3.2.2 若器材供應時並非無菌，但使用前
8、必須滅菌，則其試驗材料須依製造商建議的方法滅菌，並須在試驗全程中以無菌處理。 在應用到試驗系統前，界定試驗材料的製備時，應考慮滅菌方法或滅菌劑對器材之作用。 3.3.2.3 在使用時不須滅菌的器材，其試驗材料須依其供 應的狀況加以應用，並在試驗全程中以無菌處理。 3.3.3 液體須以下列之一方式加以試驗 (1) 直接放置或 (2) 置於具生物惰性之吸收基質上。 備考：濾盤可適用。 3.3.4 如果適當的話，被歸類為超強 吸收材料須在試驗前與培養基浸泡以避免在試驗培養器皿內吸收培養基。 4. 細胞株 4.1 最好使用已確立的細胞株，並須由已被認證的菌種中心取得細胞株 (3)。 4.2 如果需要特
9、殊之敏感度，在試驗反應的再現性與精確性可以獲得確認下，須採用初代細胞培養株、細胞株以及直接由活體組織所做的有機型細胞培養。 4.3 如果要保存培養細胞之細胞株，須將細胞儲存於含二甲碸或甘油等冷凍保護劑的相關培養基裡，並保存在 -80 或更低的溫度下。長時間的保存 (幾個月到幾年 )唯有在 -130 或更低的溫度下才可行。 4.4 只有不含黴漿菌的細胞可以被用來進行試驗。在使用前保存細胞株要先試驗確認其不含黴漿菌。 5. 培養基 5.1 培養基須是無菌的。 5.2 含血清或不含血清的培養基須符合所選用細胞株成長的需求。 備考：如果不會對檢測有不良影響，培養基內可以加入抗生素。 培養基的穩定性會隨
10、其成份與儲存條件而改變，含血清與麩胺的培養基須儲存 4 CNS 14393-5, T 5013-5 於 2 oC 至 8 oC，且不可超過一星期不含血清之含麩胺培養基須保存於 2 oC至 8 oC，且不可超過兩星期。 5.3 培養基須維持其 pH 值介於 7.2 至 7.4。 6. 保存細胞株之製備 6.1 利用所選用的細胞株與培養基準備足量的細胞以完成試驗。如果細胞是由儲存之細胞株所加以培養的，先除去保存細胞株所含有的冷凍保護劑，在使用前至少進行一次繼代培養。 6.2 依適用於細胞株的方法，以酵素和 (或 )機械分離法移除及再懸浮細胞。 註 (3) 舉例來說，建議採用的細胞株是美國細胞收集中
11、心或我國 食品工業發展研究中心細胞保存中心 CCL1 (NCTC clone 929)、 CCL163 (Balb/3T3 clone A31)與 CCL75(WI-38)、 CCL81(Vero)與 CCL10 (BHK-21 (C-13)與 V-79 379A。這些信息的提 供只是為了本標準採用者之方便，國家標準並不為這些材料背書。其他細胞株若能導致相同或更恰當的結果 ，同樣可以加以採用。 7. 試驗步驟 7.1 重複試驗的數目 至少須使用三組重複的試驗樣品與對照物。 7.2 萃取物的試驗 7.2.1 本試驗可對細胞毒性進行定性與定量之評估。 7.2.2 用移液管從持續攪拌的細胞懸 浮液中
12、移出定量之細胞懸浮液，將其置於每一個培養器皿中以備萃取物之 曝露，培養器皿數量要足夠。以溫和的轉動讓細胞分佈於每一培養器皿的表面。 7.2.3 將細胞置於 (372)oC 含或不含 5 %之二氧化碳培養箱中培養。含不含二氧化碳端視何者對所選用的培養基為適當的緩衝系統而定。 這試驗須在次群集單層細胞或新鮮懸浮的細胞上進行。 只有適當之低細胞密度才可使用於菌落形成分析。 7.2.4 試驗前，以顯微鏡確認培養細胞的次群集與形態。 7.2.5 在下列條件下執行試驗： (1) 原萃取物上，與 (2) 以培養基為稀釋劑之萃取物系列稀釋液上。 如果使用單層細胞進行試驗， 先移除並拋棄培養細胞之培養基，再以定
13、量之萃取物或其稀釋液加入每一個培養器皿內。 如果使用懸浮細胞進行試驗， 在準備好懸浮細胞後馬上將萃取物或其稀釋液加入重複的培養器皿內。 7.2.6 當使用非生理性的萃取液時， 如水，則萃取液在以培養基稀釋時，須以最高之生理相容之濃度進行試驗。 備考：建議以濃縮的培養基，如濃縮兩倍、五倍，用來稀 釋液態的萃取液。 7.2.7 將定量的空白試劑與陰性和陽性對照物加入額外重複的培養器皿內。 5 CNS 14393-5, T 5013-5 備考：若可行，也可以進行新鮮培養基之對照試驗。 7.2.8 將這些培養器皿依第 7.2.3 節的條件培養，並依所選用特定檢測法培養適當的期間。 7.2.9 培養至少
14、 24 h 後，依第 7.5 節判定所產生細胞毒性的效應。 7.3 直接接觸之試驗 7.3.1 這試驗容許對細胞毒性進行定性與定量之評估。 7.3.2 用移液管從持續攪拌的細胞懸 浮液中移出定量之細胞懸浮液，將其置於每一個培養器皿中以備試驗樣品 之直接曝露，培養器皿數量要足夠。以溫和的水平轉動讓細胞均勻分佈於每一培養器皿的表面。 7.3.3 將細胞置於 (372)含或不含 5 %之二氧化碳培養箱中培養。含不含二氧化碳端視何者對所選用的培養 基為適當的緩衝系統而定，直到培養細胞成長至次群集階段。 7.3.4 試驗前，以顯微鏡確認培養細胞的次群集與形態。 7.3.5 移除並拋棄培養細胞之培養基，然
15、後在每個培養器皿中加入新鮮的培養基。 7.3.6 在每個備份培養器皿的中心位置，小心地將試驗樣品 的試樣擺在細胞層上，並確認試樣大概覆蓋十分之一細胞層的面積。 小心操作以避免試樣不必要之 移動，因為不必要之移動可能對細胞造成物理性的傷害，例如造成細胞剝落形成碎片。 備考：若可行，可以在加入細胞前先把試樣放入培養培養器皿內。 7.3.7 製備重複的培養器皿供陰性與陽性對照材料使用。將 這些培養器皿依第7.3.3 節之條件加以培養，並依所選用的特定檢 測法培養適當的期間 (至少24 h)。 7.3.8 拋棄浮在上層之培養基，並依第 7.5 節測定細胞毒性的效果。 7.4 非直接接觸之試驗 7.4.
16、1 瓊脂擴散試驗 7.4.1.1 這試驗容許對細胞毒性進行定性之評估。無法在瓊脂層擴散或是會與瓊脂發生反應的濾取物不適合用此試驗。 7.4.1.2 用移液管從持續攪拌的細胞懸浮液中移出定量之細胞懸浮液，將其置於每一個培養器皿中以備試驗，重複的培養器皿數量要足夠。以溫和的水平轉動讓細胞均勻分佈於每一培養器皿的表面。 7.4.1.3 將細胞置於 (372)含或不含 5 %之二氧化碳培養箱中培養。含不含二氧化碳端視何者對所選用的培養基為適當的緩衝系統而定，直到培養細胞至生長曲線對數期的終點，形成適當的群集階段。 7.4.1.4 試驗前，以顯微鏡確認培養細胞的次群集與形態。 7.4.1.5 移除並拋棄
17、培養器皿中之培養基，然後以含血清的新鮮培養基與溶化之瓊脂混合，使其瓊脂之最終質量濃度介於 0.5 %至 2 %，在用移液管取出定量之混合液加入每個培養器皿內。細胞培養只可以選用適合哺乳類細胞成長的瓊脂。瓊脂培養基的混合物須為液體狀態，並保持 6 CNS 14393-5, T 5013-5 於與哺乳類細胞匹配的溫度。 備考：瓊脂有不同之分子量範圍與純度。 7.4.1.6 在每個培養器皿的固化瓊脂層上，小心地放置重複的試驗樣品，並確認試樣大約覆蓋十分之一細胞層的面積。 在放置瓊脂層之前，吸水性材料要以培養基預浸，以避免造成瓊脂脫水。 7.4.1.7 製備重複的培養器皿供陰性與陽性對照材料使用。 7
18、.4.1.8 將這些培養器皿依第 7.4.1.3 節之條件培養 24 h 至 72 h。 7.4.1.9 在仔細從瓊脂層移去試樣前後，檢查細胞以測定所產生的細胞毒性效應。 應用如中性紅之活性染劑有助於偵測細胞毒性。活性染劑可在試樣培養之前或之後加入。若染劑是在培養之前加入，則培養細胞必須避免光照以免染劑之光活化作用引發細胞之傷害。 7.4.2 過濾材料擴散試驗 7.4.2.1 這試驗容許對細胞毒性進行定性之評估。 7.4.2.2 將孔徑為 0.45 m 不含界面活性劑的過濾材料放入每個培養器皿，並從持續攪拌的細胞懸浮液 中取出一定量加入於每一個培養器皿中以備試驗，重複培養器皿數量要足夠。以溫和
19、的水平轉動讓細胞均勻分佈於每一過濾材料的表面。 7.4.2.3 將細胞置於 (372)含不含二氧化碳培養箱中培養。含或不含 5 %之二氧化碳，端視何者對所選用的培養基為適當的緩衝系統而定，直到培養細胞至生長曲線對數期的終點，形成適當的群集階段。 7.4.2.4 試驗前，以顯微鏡確認培養細胞的次群集與形態。 7.4.2.5 移除並拋棄培養器皿中之培養基，移出過濾材料將含細胞之面向下放置在固化瓊脂層上 (參見第 7.4.1.6 節 )。 7.4.2.6 在過濾材料無細胞的一面小心地放置重複的試驗樣品，並在過濾材料上之無反應性環形物內留置液態萃取物與新鮮混合成份。 7.4.2.7 製備重複的過濾材料
20、供陰性試樣與陽性對照試樣使用。 7.4.2.8 將這些培養器皿依第 7.4.2.3 節之條件培養 2 h10 min.。 7.4.2.9 小心地將試樣由過濾材料 移除，並小心的分開過濾材料與瓊脂層表面。 7.4.2.10 使用適當的染色程序以測定細胞毒性效應。 7.5 細胞毒性測定 7.5.1 以定性或定量的方法測定細胞毒性效應。 (1) 定性評估：以顯微技術檢查細胞，必要時可採用細胞化學染色。例如，可針對細胞之整體性形態、空泡化、剝離性、細胞溶解與細胞膜完整等變化進行評估。正常形態上的變化須於試驗報告中以描述性或數值性方式加以記載。以下所列是對試驗材料有用的分級方式。 7 CNS 14393
21、-5, T 5013-5 細胞毒性級數 說明 0 細胞毒性 1 輕微細胞毒性 2 中度細胞毒性 3 嚴重細胞毒性 評估的方法與評估結果須包含於試驗報告中。 (2) 定量評估：量測細胞死亡、細胞成長抑制、細胞增殖或 菌落形成等參數。細胞數目、蛋白質量、酵素釋出、活性染劑釋出、活性染劑減少或是其他可量測的參數都可以用客觀的方法加以量化。客觀的量測與反應須記載於試驗報告中。 備考： 為了某些 測定細胞毒性之特殊方法，起始點或基線之細胞培養控制可能會有需要。 7.5.2 要確信已小心選擇評估的方法 ，因為倘若試驗的試樣會釋放出干擾試驗系統或量測的材料，則試驗結果可能不正確。 備考：只有評估細胞存活性才
22、能確實地試驗可能會釋出甲醛的物質。 7.5.3 若重複的細胞培養器皿的試驗結果有明顯的差異，則試驗不適當或不正確。 7.5.4 若陰性、陽性或與任 何其它之對照物 (如參考物、介質、空白物、試劑等 )對試驗系統都沒有預期的反應，則重做試驗。 8. 試驗報告 試驗報告須包含下列細節： (1) 樣品描述； (2) 細胞株與選擇之判斷； (3) 培養基； (4) 檢測方法與合理性； (5) 萃取步驟 (若可行 )及溶出物質的性質和濃度； (6) 陰性、陽性與其他對照物； (7) 細胞反應與其他觀察；和 (8) 任何與結果評估所需之相關資料。 9. 結果之評估 結果之整體評估須由有能力根據試驗資料作成
23、有意義決策的人來執行，如果重複試樣的結果不一致或不正確，須重做試驗。 引用標準： CNS 14393-1 醫療器材生物性評估 第一部分：評估與試驗。 CNS 14393-2 醫療器材生物性評估 第二部分：動物福利之規定。 ISO 10993-12： Biological evaluation of medical devices Part 12:Sample preparation and reference materials. 相對應國際標準： Biological evaluation of medical devices Part 5： Tests for in vitro cytot
24、oxicity 8 CNS 14393-5, T 5013-5 中英文名詞對照 Absorbent matrix 吸收劑基質 Agar 瓊脂 Agitation 攪動 Cell line 細胞株 Cell lysis 細胞破裂、細胞溶解 Chemical solubility 化學溶解度 Colony-forming assay 菌落形成分析 Cryoprotectant 冷凍保護劑 Cytotoxicity 細胞毒性 Deposition 沈澱 Detachment 剝離性 Enzymatic and/or mechanical disaggregation 酵素與 (或 )機械分散法 Extractive vehicle 萃取媒介 Glutamine 麩胺醯胺酸 Incubation 培養 Microtitre 微皿 Mycoplasma 黴漿菌屬 Organo-tin stabilized poly 有機錫穩定高分子 Osmolarity 滲透性 Reagent blank 空白試劑 Subconfluency 次群集 Subculture 繼代培養 Superabsorbent 超強吸收劑 Sterility 無菌性質 Vacuolization 空泡化
