1、Dezember 2009DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 11DIN Deutsches Institut fr Normung e.V. Jede Art der Vervielfltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut fr Normung e.V., Berlin, gestattet.ICS 07.100.30!$
2、XyY“1538654www.din.deDDIN 10124ATP-Messung Grundlagen zur Erfassung des Hygienestatus mittels BiolumineszenzATP measuring Fundamentals for the measuring of the hygienic status with bioluminescence-methodMesurage ATP Fondements lenregistrement du statut dhygiene par bioluminescenceAlleinverkauf der N
3、ormen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 20 SeitenB55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 Inhalt Seite Vorwort . 3 1 Anwendungsbereich 4 2 Normative Verweisungen. 4 3 Begriffe 4 4 Kurzbeschreibung 6 5 Chemikalien und Reagenzi
4、en 6 6 Gerte. 8 7 Durchfhrung 8 8 Kalibration und Qualittskontrolle 11 9 Untersuchungsbericht . 12 Anhang A (informativ) Aufnahme einer Standardkurve, Berechnung der Przisionsdaten und Prfung der Linearitt 13 Anhang B (informativ) Verfahren zur Prfung auf Temperatureinflsse 17 Anhang C (informativ)
5、Verfahren zur Prfung auf chemische beziehungsweise physikalische Wechselwirkungen . 18 Literaturhinweise . 20 2 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 Vorwort Diese Norm wurde vom Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL), Arb
6、eits-ausschuss NA 057-01-06 AA Mikrobiologische Lebensmitteluntersuchung einschlielich Schnellverfahren“, erarbeitet. 3 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 1 Anwendungsbereich Diese Norm legt die Grundlagen zur Reinheitsberwachung und zur Kontrolle
7、des Reinigungserfolges durch Erfassung des mikrobiellen und somatischen Adenosintriphosphats (ATP) mit dem Luciferin-Luciferase-System (Biolumineszenz) im Bereich der Herstellung und Distribution von Lebensmitteln und Futtermitteln fest. 2 Normative Verweisungen Das folgende zitierte Dokument ist fr
8、 die Anwendung dieses Dokuments erforderlich. Bei datierten Verweisungen gilt nur die in Bezug genommene Ausgabe. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe des in Bezug genommenen Dokuments (einschlielich aller nderungen). DIN 10113-1, Bestimmung des Oberflchenkeimgehaltes auf Einrichtung
9、s- und Bedarfsgegenstnden im Lebensmittelbereich Teil 1: Quantitatives Tupferverfahren 3 Begriffe Fr die Anwendung dieses Dokuments gelten die folgenden Begriffe. 3.1 Adenosintriphosphat ATP in allen Zellen niederer und hherer Lebewesen vorhandenes Stoffwechselmolekl 3.2 Biolumineszenz durch biologi
10、sche Ursachen hervorgerufenes Lichtsignal BEISPIEL Ein Beispiel sind Glhwrmchen. 3.3 Biomasse Gesamtmasse des organischen Materials biologischen Ursprungs 3.4 Desinfektion Verfahren zur Abttung von Mikroorganismen auf ein Niveau, das weder gesundheitsschdlich ist noch die Qualitt der Lebensmittel be
11、eintrchtigt 3.5 extrazellulres ATP ATP auerhalb biologischer Zellen 3.6 Desinfektionsmittel chemisches und physikalisches Mittel, das dazu beitrgt, eine Desinfektion zu erzielen 3.7 Gesamt-ATP Summe aus intrazellulrem und extrazellulrem ATP 3.8 Inhibition Abschwchung des Lichtsignals durch chemische
12、 oder physikalische Interferenz der Lumineszenzreaktion 4 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 3.9 interner Standard Vergleichsmenge ATP in einer Lumineszenzprobe zur Quantifizierung der ATP-Menge in der Probe 3.10 intrazellulres ATP ATP in mikrobiel
13、len und/oder somatischen Zellen 3.11 Linearitt Grad der Konformitt mit einer Regressionsgeraden zwischen der Menge an Biomasse oder ATP und der Strke des Lichtsignals 3.12 Lumineszenzreagenz Enzymmischung, die aus Luciferin und Luciferase besteht und die in Verbindung mit ATP zur Biolumineszenz fhrt
14、 3.13 Luminometer Gert zur Messung von Licht 3.14 mikrobielles ATP ATP von Mikroorganismen 3.15 Mikroorganismen einzellige prokaryotische und eukaryotische Organismen wie Bakterien, Hefen und Schimmelpilze 3.16 Reinigung Entfernung unerwnschter Substanzen von Rumen, Anlagen und Einrichtungen ANMERKU
15、NG Unerwnschte Substanzen sind zum Beispiel Lebensmittelreste, Belge usw. 3.17 Reinigungsmittel chemische Verbindungen, die zur Reinigung verwendet werden 3.18 relative Lichteinheiten RLE RLU (en: Relative light units) Maeinheit fr die Lichtemission in Luminometern 3.19 somatisches ATP nicht mikrobi
16、elles ATP in somatischen Zellen 5 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 4 Kurzbeschreibung 4.1 Allgemeines In Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen sowie in allen tierischen und pflanzlichen Materien einschlielich Lebensmitteln und Lebensmittelresten is
17、t Adenosintriphosphat (ATP) enthalten. Aus der ATP-Menge kann die Menge an Biomasse mit Hilfe der Luciferin-Luciferase-Reaktion geschtzt werden. 4.2 Erfassung des Gesamt-ATP-Gehaltes Eine Oberflche wird mit einem Tupfer oder durch Sammlung einer Waschwasserprobe beprobt. Die ATP-Menge in der Probe s
18、piegelt die Menge an ATP bzw. der Biomasse auf der Oberflche wider. Die ATP-Menge in der Probe wird mit dem Luciferin-Luciferase-Enzymkomplex der Glhwrmchen bestimmt, siehe nachfolgende Reaktionen. Das Reaktionsprodukt ist Licht, das mit einem Luminometer gemessen wird. Die bei der Enzymreaktion ent
19、stehende Lichtmenge ist proportional zur ATP-Menge in der Probe. ichtLAMPCO*inOxyluciferOAMP-Luciferin-LuciferasePPAMP-Luciferin-LuciferaseATPLuciferinLuciferase22Mg+* instabiler angeregter Zustand Die Messdaten werden in relativen Lichteinheiten (RLE) ausgedrckt. Der RLE-Wert einer Probe ist daher
20、ein Ma fr die Reinheit der beprobten Oberflche. 4.3 Erfassung des mikrobiellen ATP-Gehaltes Fr die alleinige Erfassung des ATP aus Mikroorganismen wird zuvor durch geeignete Verfahren das somatische ATP beseitigt. Zur Beseitigung des somatischen ATP wird das in dem jeweiligen Test-Kit hierfr vorgese
21、hene Reagenz verwendet. ANMERKUNG Es knnen vom Hersteller zur Verfgung gestellte Reagenzienstze verwendet werden. 5 Chemikalien und Reagenzien 5.1 Allgemeines Falls nicht anders angegeben, sind analysenreine Chemikalien und Reagenzien zu verwenden. 5.2 Wasser Alle Reagenzien und Verdnnungen mssen mi
22、t ATP-freiem Wasser zubereitet werden. ANMERKUNG 1 Adenosintriphosphat ist eine sehr stabile Verbindung, die durch Autoklavieren nicht entfernt werden kann. Lokale Wasserreinigungssysteme (Umkehrosmose oder Ionenaustausch) neigen zu biologischer Kontamination und sind keine sichere Quelle ATP-freien
23、 Wassers. ANMERKUNG 2 Frisches zweifach in Glasapparaturen destilliertes Wasser kann als ATP-frei angesehen werden, sofern die Auffangbehlter ATP-frei sind. Alternativ wird die Verwendung von Wasser pharmazeutischer Qualitt wie pyrogen-freies Wasser fr Injektionszwecke empfohlen. 6 B55EB1B3E14C22109
24、E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 5.3 Luciferin Enzymsubstrat fr die Biolumineszenzreaktion. Das Substrat ist kommerziell als Lumineszenzreagenz“ gefriergetrocknet als Mischung aus Luciferin und Luciferase erhltlich. 5.4 Luciferase Enzym der Biolumineszenzreaktion
25、. Das Substrat ist kommerziell als Lumineszenzreagenz“ gefriergetrocknet als Mischung aus Luciferin und Luciferase erhltlich. Es wird dann nach Angaben des Herstellers in einer geeigneten Pufferlsung oder in Wasser angesetzt. 5.5 Pufferlsung Die Pufferlsung wird fr den Messvorgang fr 5.3 und 5.4 ver
26、wendet. Die Luciferase weist ein pH-Optimum von 7,75 bis 7,8 auf. Deshalb sollte der pH-Wert der verwendeten Pufferlsung bei etwa 7,8 liegen. Die Pufferkapazitt der verwendeten Pufferlsung muss zur Neutralisation des in typischen Proben vorhandenen Sure/Base-Gehaltes ausreichen. ANMERKUNG 1 Bei zu n
27、iedriger Pufferkapazitt kann das Lichtsignal bzw. die Nachweisreaktion weitgehend oder ganz inhibiert werden. Phosphatpuffer drfen nicht verwendet werden, weil Phosphat-Ionen die Enzymreaktion inhibieren. Die Pufferlsung sollte ein Magnesiumsalz enthalten, weil bei der Glhwrmchen-Lumineszenzreaktion
28、 Mg2+-Ionen als Katalysator bentigt werden. ANMERKUNG 2 Eine typische Pufferlsung in kommerziellen Reagenzienstzen ist HEPES-Puffer1 )mit einem pH-Wert von 7,75. 5.6 Extraktionsmittel Typische Extraktionsmittel bzw. Extraktionsmethoden sind: a) physikalisch: Dampf, Ultraschall; b) chemisch: Chloress
29、igsure; Detergentien, z. B. Triton X-1002). ANMERKUNG Es knnen vom Hersteller zur Verfgung gestellte Reagenzienstze verwendet werden. 5.7 Neutralisationsmittel, zur Neutralisation von chemischen Extraktionsmitteln nach 5.6 b). 1) HEPES-Puffer ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt
30、. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerkennung des genannten Produktes durch DIN. 2) Triton X-100 ist ein Beispiel fr ein geeignetes handelsbliches Produkt. Diese Angabe dient nur zur Unterrichtung der Anwender dieser Norm und bedeutet keine Anerke
31、nnung des genannten Produktes durch DIN. 7 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 6 Gerte 6.1 Allgemeines Alle Glaswaren mssen vor dem Gebrauch sorgfltig mit phosphatfreien Detergentien gereinigt und anschlieend mit Leitungswasser sowie 3-mal mit ATP-f
32、reiem Wasser gesplt werden. Smtliche Pipetten, Pipettenspitzen sowie Einwegmaterialien aus Kunststoff mssen ATP-frei sein. 6.2 Tupfer, mssen zur Beprobung der Oberflchen ATP-frei sein. ANMERKUNG Empfehlenswert sind Tupfer aus synthetischen Materialien. 6.3 Biolumineszenz-Messsysteme Luminometer, in
33、temperierter Umgebung, thermostatiert oder mit einer Temperaturkompensationsfunktion. Die Messmethodik des Luminometers muss der Reaktionskinetik entsprechen. ANMERKUNG Unterschiedliche Luminometer sind nicht gegeneinander kalibriert, so dass bei gleichen ATP-Konzentrationen nicht in jedem Fall die
34、gleichen Anzeigewerte (RLE) erhalten werden mssen. Ein Abgleich von verschiedenen Luminometern kann anhand einer ATP-Standardkurve erfolgen. 7 Durchfhrung 7.1 Allgemeines Wenn vorgefertigte, integrierte Reagenzienstze (Kits“) verwendet werden, sind die Herstellerangaben zu befolgen. 7.2 Probenahme P
35、roben knnen von einer Oberflche entweder mit einem ATP-freien Tupfer oder durch Sammeln des Splwassers gewonnen werden, wie hauptschlich beim Reinigen eines geschlossenen Clean-in-Place-(CIP)-Systems. Bei der Beprobung von Oberflchen mittels ATP-freiem Tupfer werden die Probenahmestellen und -gren f
36、estgelegt, z. B. durch Anlegen einer Schablone nach DIN 10113-1. Werden Tupfer mit Extraktionsmittel befeuchtet, muss die Oberflche nach der Probenahme wieder gereinigt werden. Flssige Proben oder Tupfer sollten vor der Untersuchung nicht fr mehr als 30 min aufbewahrt werden, sofern nicht validiert
37、wurde, dass dies die Ergebnisse nicht beeinflusst. 7.3 Hintergrundkorrektur Wenn das Luminometer kein stabilisiertes, von Umgebungslicht und Temperatur unabhngiges Hintergrund-signal aufweist, sollte das Hintergrundsignal des Gertes unmittelbar vor der Messung der Probe geprft werden, um eine Korrek
38、tur des Anzeigewerts bezglich des Hintergrundrauschens zu ermglichen. 8 B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09CC7B7EE8CD9NormCD - Stand 2009-12 DIN 10124:2009-12 7.4 Extraktion von ATP Vor der Zugabe der Luciferin-Luciferase-Reagenz nach 5.3 und 5.4 muss alles ATP in der Probe durch physikalische oder
39、durch chemische Lyse der Zellen freigesetzt werden. Es muss ein Extraktionsmittel (siehe 5.6) eingesetzt werden, dessen Effizienz zur Extraktion von ATP aus allen Zellen der Probe ausreicht. Wenn das verwendete Extraktionsmittel das natrlich vorkommende Enzym Phosphatase (ATPase“) nicht inhibiert, m
40、uss die Zeit zwischen Extraktion und Lichtmessung kontrolliert werden, um Signalvernderungen wegen des enzymatischen Abbaus von ATP in der Probe zu vermeiden. ANMERKUNG Sofern durch das eingesetzte Extraktionsmittel das in der Probe enthaltene Enzym Phosphatase nicht zerstrt oder inhibiert wird, unt
41、erliegt das gesamte extrazellulre ATP einem enzymatischen Abbau. 7.5 Neutralisation des Extraktionsmittels Wenn zur Extraktion von ATP ein chemisches Extraktionsmittel nach 5.6 b) eingesetzt wird, sollte es vor der Zugabe der Luciferin-Luciferase-Mischung neutralisiert werden. Andernfalls kann die L
42、umineszenzreaktion dadurch inhibiert werden. 7.6 Zugabe der Luciferin-Luciferase-Mischung Das Luciferin-Luciferase-Reagenz nach 5.3 und 5.4 wird zur Probe gegeben, und es wird sofort schnell und effizient gemischt. Sofort im Anschluss daran muss die Lichtintensitt ermittelt werden. Die Lumineszenzre
43、aktion folgt gewhnlich einer Enzymkinetik erster Ordnung mit einer Signalabnahme-geschwindigkeit von 5 % bis 10 % je Minute whrend der ersten 5 min bis 15 min, in Abhngigkeit von der genauen Formulierung. Wenn die Signalabnahmegeschwindigkeit grer als 1 % je Minute ist, muss die Lichtmessung sofort
44、nach Zugabe des Enzym-Substratgemisches nach 5.3 und 5.4 vorgenommen werden. 7.7 Zugabe eines internen Standards Sofern die ATP-Menge der Probe durch Zugabe eines internen ATP-Standards quantifiziert werden soll, muss sofort nach Ablesen des Probensignals nach 7.6 eine bekannte Menge ATP zur Probe z
45、ugesetzt und gut gemischt werden. Vorzugsweise sollte die Konzentration des ATP-Standards mindestens um den Faktor 10 ber der Konzentration von ATP in der Probe liegen. Sofern die Volumennderung der Probe durch Zugabe des ATP-Standards nicht vernachlssigbar ist, muss das bei der spteren Berechnung der ATP-Konzentration der Probe nach 7.9, siehe Gleichung
