1、September 2005DEUTSCHE NORM Normenausschuss Lebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL) im DINPreisgruppe 13DIN Deutsches Institut f r Normung e.V. Jede Art der Vervielf ltigung, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung des DIN Deutsches Institut f r Normung e. V., Berlin, gestattet.ICS 65.120
2、CN_ 9617289www.din.deXDIN EN ISO 13903Futtermittel Bestimmung des Aminos uregehalts (ISO 13903:2005);Deutsche Fassung EN ISO 13903:2005Animal feeding stuffs Determination of amino acids content (ISO 13903:2005);German version EN ISO 13903:2005Aliments des animaux Dtermination de la teneur en acides
3、amins (ISO 13903:2005);Version allemande EN ISO 13903:2005Alleinverkauf der Normen durch Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin www.beuth.deGesamtumfang 23 SeitenDIN EN ISO 13903:2005-092Nationales VorwortDiese Europische Norm fllt in den Zustndigkeitsbereich des Technischen Komitees CEN/TC 327Futtermittel
4、 Probenahmeverfahren und Untersuchungsverfahren (Sekretariat: Niederlande). Die der Normzu Grunde liegende internationale Norm ISO 13903:2005 ist im ISO/TC 34/SC 10 Futtermittel (Sekretariat:Niederlande) erarbeitet worden. Auf Beschluss des CEN/TC 327 wurde ISO 13904 im parallelenAbstimmungsverfahre
5、n als Europische Norm angenommen.Eine Mitarbeit des DIN im CEN/TC 327 erfolgt derzeit nicht, da von Seiten der betroffenen Wirtschaftskreisekein Interesse an diesen Normungsarbeiten bekundet wird. Thematisch zustndig ist der NormenausschussLebensmittel und landwirtschaftliche Produkte (NAL).Es wird
6、auf die Mglichkeit hingewiesen, dass einige Texte dieses Dokuments Patentrechte berhren knnen,ohne dass diese vorstehend identifiziert wurden. Das DIN ist nicht dafr verantwortlich, einige oder allediesbezglichen Patentrechte zu identifizieren.EUROPISCHE NORM EUROPEAN STANDARD NORME EUROPENNE EN ISO
7、 13903 Mai 2005 ICS 65.120 Deutsche Fassung Futtermittel Bestimmung des Aminosuregehalts (ISO 13903:2005) Animal feeding stuffs Determination of amino acids content (ISO 13903:2005) Aliments des animaux Dtermination de la teneur en acides amins (ISO 13903:2005) Diese Europische Norm wurde vom CEN am
8、 19. April 2005 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschftsordnung zu erfllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europischen Norm ohne jede nderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzten Stand befindliche Listen dieser natio
9、nalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhltlich. Diese Europische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Franzsisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener V
10、erantwortung durch bersetzung in seine Landessprache gemacht und dem Management-Zentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen. CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, I
11、rland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, den Niederlanden, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Schweden, der Schweiz, der Slowakei, Slowenien, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn, dem Vereinigten Knigreich und Zypern. EUROPISCHES KOMITEE FR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FO
12、R STANDARDIZATION COMIT EUROPEN DE NORMALISATIONManagement-Zentrum: rue de Stassart, 36 B-1050 Brssel 2005 CEN Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.Ref. Nr. EN ISO 13903:2005 DEN ISO 13903:2005 (D) 2
13、 Vorwort Dieses Dokument (EN ISO 13903:2005) wurde vom Technischen Komitee ISO/TC 34 Food products“ in Zusammenarbeit mit dem Technischen Komitee CEN/TC 327 Futtermittel Probenahmeverfahren und Untersuchungsverfahren“ erarbeitet, dessen Sekretariat vom NEN gehalten wird. Diese Europische Norm muss d
14、en Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Verffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis November 2005, und etwaige entgegenstehende nationale Normen mssen bis November 2005 zurckgezogen werden. Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschftsordnung sind die nationalen Norm
15、ungsinstitute der folgenden Lnder gehalten, diese Europische Norm zu bernehmen: Belgien, Dnemark, Deutschland, Estland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Lettland, Litauen, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, sterreich, Polen, Portugal, Schweden, Schweiz, Slowakei, Sl
16、owenien, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn, Vereinigtes Knigreich und Zypern. Anerkennungsnotiz Der Text von ISO 13903:2005 wurde vom CEN als EN ISO 13903:2005 ohne irgendeine Abnderung genehmigt. Grundlage von ISO 13903 ist die Richtlinie 98/64/EG der Kommission vom September 1998 1. EN ISO 13
17、903:2005 (D) 3 Inhalt Seite Vorwort 2 1 Anwendungsbereich .4 2 Kurzbeschreibung.4 3 Reagenzien und Materialien .5 4 Gerte .7 5 Durchfhrung.7 6 Auswertung10 7 Przision.11 8 Verwendung von Referenzmaterialien 12 9 Bemerkungen zum Verfahren 12 Anhang A (informativ) Ergebnisse von Ringversuchen .13 Anha
18、ng B (informativ) Beispiele von Chromatogrammen19 Literaturhinweise21 EN ISO 13903:2005 (D) 4 1 Anwendungsbereich Diese Internationale Norm beschreibt die Bestimmung der freien (synthetischen und natrlichen) Amino-suren und der Gesamtaminosuren (peptidgebundene und freie) in Futtermitteln unter Verw
19、endung eines Aminosurenanalysators oder einer HPLC-Anlage. Sie gilt fr folgende Aminosuren: Summe von Cystin und Cystein; Methionin; Lysin; Threonin; Alanin; Arginin; Asparaginsure; Glutaminsure; Glycin; Histidin; Isoleucin; Leucin; Phenylalanin; Prolin; Serin; Tyrosin; Valin. Das Verfahren untersch
20、eidet nicht zwischen Aminosuresalzen und auch nicht zwischen D- und L-Formen von Aminosuren. Es gilt nicht fr die Bestimmung von Tryptophan oder hydroxylhaltigen Analogen von Aminosuren. Die Grenzen der quantitativen Bestimmung hngen von der chromatographischen Einrichtung ab, jedoch so geringe Geha
21、lte wie 0,3 g/kg Gesamtlysin, 0,25 g/kg Gesamtmethionin, 0,35 g/kg Gesamtcystin plus -cystein, 0,2 g/kg Gesamtthreonin, 0,035 g/kg freies Lysin, 0,035 g/kg freies Methionin und 0,03 g/kg freies Threonin knnen gewhnlich analysiert werden. ANMERKUNG Es knnte eine noch niedrigere Bestimmungs- oder Nach
22、weisgrenze erreichbar sein, aber das ist von den Anwendern zu besttigen. 2 Kurzbeschreibung 2.1 Freie Aminosuren Die freien Aminosuren werden mit verdnnter Salzsure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makro-molekle werden mit Sulfosalicylsure ausgefllt und durch Filtration entfernt. Die abf
23、iltrierte Lsung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosuren werden durch Ionenaustauschchromatographie getrennt und nach der Reaktion mit Ninhydrin bei einer Wellenlnge von 570 nm photometrisch nachgewiesen. EN ISO 13903:2005 (D) 5 2.2 Gesamtaminosuren Das zu whlende Verfahren hngt v
24、on den zu untersuchenden Aminosuren ab. Cystin/Cystein und Methionin mssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss in Hydrolysaten von nicht oxidierten Proben bestimmt werden. Alle anderen in Abschnitt 1 aufgefhrten Amino-suren knnen entweder in der oxidie
25、rten oder nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Die Oxidation erfolgt bei 0 C mit einem Gemisch von Perameisensure und Phenol. berschssiges Oxidationsreagenz wird durch Natriumdisulfit zersetzt. Die oxidierte oder nicht oxidierte Probe wird 23 h mit Salzsure (c = 6 mol/l) hydrolysiert. Das Hydroly
26、sat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Amino-suren werden durch Ionenaustauschchromatographie getrennt und nach der Reaktion mit Ninhydrin bei einer Wellenlnge von 570 nm (bei Prolin 440 nm) photometrisch nachgewiesen. 3 Reagenzien und Materialien Es sind nur Reagenzien von anerkanntem
27、 Analysengrad, falls nicht anders festgelegt, zu verwenden. 3.1 Wasser, doppelt destilliertes Wasser oder Wasser von gleichwertiger Reinheit (Leitfhigkeit 10 S). 3.2 Wasserstoffperoxid, w = 30 %. 3.3 Ameisensure, w = 98 % bis 100 %. 3.4 Salzsure, Dichte etwa 1,19 g/ml. 3.5 2,2-Thiodiethanol (Thiodig
28、lycol). 3.6 Leichtbenzin, Siedebereich 40 C bis 60 C. 3.7 Norleucin oder eine andere als innerer Standard geeignete Verbindung. 3.8 Stickstoffgas Sauerstoffgehalt 1 ppm (parts per million). 3.9 Aminosuren. 3.9.1 Die in Abschnitt 1 aufgefhrten Substanzen. Zu verwenden sind nur Reinverbindungen ohne K
29、ristallwasser. Sie sind vor der Verwendung eine Woche unter Vakuum ber P2O5oder H2SO4zu trocknen. 3.9.2 Cysteinsure. 3.9.3 Methioninsulfon. 3.10 Natriumhydroxidlsung I, c = 7,5 mol/l. 300 g NaOH sind in Wasser (3.1) zu lsen und es ist auf 1 l aufzufllen. 3.11 Natriumhydroxidlsung II, c = 1 mol/l. 40
30、 g NaOH sind in Wasser (3.1) zu lsen und es ist auf 1 l aufzufllen. 3.12 Ameisensure-Phenol-Lsung. 889 g Ameisensure (3.3) sind mit 111 g Wasser (3.1) zu mischen und 4,73 g Phenol sind zuzugeben. 3.13 Hydrolysegemisch, c = 6 mol/l HCl, mit 1 g Phenol je Liter. Zu 492 ml HCl (3.4) ist 1 g Phenol zuzu
31、geben und es ist mit Wasser (3.1) auf 1 l aufzufllen. EN ISO 13903:2005 (D) 6 3.14 Extraktionsgemisch, c = 0,1 mol/l HCl, mit 2 % Thiodiglycol. 8,2 ml HCl (3.4) sind mit etwa 900 ml Wasser (3.1) zu verdnnen. Dann sind 20 ml Thiodiglycol (3.5) zuzugeben und das Volumen ist mit Wasser auf 1 l aufzufll
32、en (3.4 und 3.5 drfen nicht direkt gemischt werden). 3.15 5-Sulfosalicylsure, = 6 %. 60 g 5-Sulfosalicylsure sind in Wasser (3.1) zu lsen und es ist mit Wasser auf 1 l aufzufllen. 3.16 Oxidationsgemisch (Perameisensure-Phenol). In einem kleinen Becherglas sind 0,5 ml Wasserstoffperoxid (3.2) mit 4,5
33、 ml Ameisensure-Phenol-Lsung (3.12) zu mischen. Das Gemisch ist zur Bildung von Perameisensure 1 h bei einer Temperatur von 20 C bis 30 C zu halten, dann ist vor der Zugabe zur Probe 15 min in einem Eiswasserbad zu khlen. Der Kontakt mit der Haut ist zu vermeiden und es ist Schutzkleidung zu tragen.
34、 3.17 Citratpuffer, c = 0,2 mol/l Na+, pH = 2,20. 19,61 g Natriumcitrat-Dihydrat, 5 ml Thiodiglycol (3.5), 1 g Phenol und 16,50 ml HCl (3.4) sind in etwa 800 ml Wasser (3.1) zu lsen. Der pH-Wert ist auf 2,20 einzustellen. Es ist mit Wasser auf 1 l aufzufllen. 3.18 Elutionspuffer, herzustellen nach d
35、en Vorschriften fr das verwendete Analysegert (4.9). 3.19 Ninhydrin-Reagenz, herzustellen nach den Vorschriften fr das verwendete Analysegert (4.9). 3.20 Standardlsungen von Aminosuren. Diese Lsungen mssen unterhalb 5 C aufbewahrt werden. 3.20.1 Standard-Stammlsung von Aminosuren (3.9.1), c = 2,5 mo
36、l/ml von jeder Aminosure in Salzsure. Sie drfen handelsblich bezogen werden. 3.20.2 Standard-Stammlsung von Cysteinsure und Methioninsulfon, c = 1,25 mol/ml. 0,211 5 g Cysteinsure (3.9.2) und 0,226 5 g Methioninsulfon (3.9.3) sind in einem 1-l-Messkolben in Citrat-puffer (3.17) zu lsen und das Volum
37、en ist mit Citratpuffer bis zur Marke aufzufllen. Die Lsung ist unterhalb 5 C nicht lnger als 12 Monate zu lagern. Diese Lsung darf nicht verwendet werden, wenn die Standard-Stammlsung (3.20.1) Cysteinsure und Methioninsulfon enthlt. 3.20.3 Standard-Stammlsung des inneren Standards, z. B. Norleucin,
38、 c = 20 mol/ml. 0,656 0 g Norleucin (3.7) sind in einem Messkolben in Citratpuffer (3.17) zu lsen und das Volumen ist mit Citratpuffer auf 250 ml aufzufllen. Die Lsung ist unterhalb 5 C nicht lnger als 6 Monate zu lagern. 3.20.4 Kalibrierlsung von Standard-Aminosuren zur Verwendung mit Hydrolysaten,
39、 c = 0,1 mol/ml bei Cysteinsure und Methioninsulfon und c = 0,2 mol/ml bei den anderen Aminosuren. In einem 100-ml-Becherglas sind 2,2 g Natriumchlorid in 30 ml Citratpuffer (3.17) zu lsen. Dann sind 4,00 ml Standard-Stammlsung der Aminosuren (3.20.1), 4,00 ml Standard-Stammlsung von Cysteinsure und
40、 Methioninsulfon (3.20.2) und 0,50 ml Standard-Stammlsung des inneren Standards (3.20.3) zuzugeben, falls dieser verwendet wird. Der pH-Wert ist mit Natriumhydroxidlsung (3.11) auf 2,20 einzustellen. Der Ansatz ist quantitativ in einen 50-ml-Messkolben zu berfhren und das Volumen ist mit Citratpuffe
41、r (3.17) bis zur Marke aufzufllen und zu durchmischen. Die Lsung ist unterhalb 5 C nicht lnger als 3 Monate zu lagern. Siehe auch die Bemerkungen in 9.1. EN ISO 13903:2005 (D) 7 3.20.5 Kalibrierlsung von Standard-Aminosuren zur Verwendung mit nach 5.3.3.2 hergestellten Hydro-lysaten sowie mit Extrak
42、ten (5.2). Die Kalibrierlsung ist nach 3.20.4 herzustellen, wobei das Natriumchlorid wegzulassen ist. Die Lsung ist unterhalb 5 C nicht lnger als 3 Monate zu lagern. 4 Gerte Die blichen Laborgerte und insbesondere die folgenden: 4.1 Rundbodenkolben, Fassungsvermgen 100 ml oder 250 ml, ausgestattet m
43、it Rckflusskhler. 4.2 Flasche aus Borosilicatglas, Fassungsvermgen 100 ml, mit Schraubverschluss, der mit Gummi oder Teflon ausgekleidet ist (z. B. Duran, Schott), zur Verwendung im Wrmeschrank. 4.3 Wrmeschrank, mit Zwangsbelftung und einer Temperaturregelung auf mindestens 2 C. 4.4 pH-Messgert, abl
44、esbar auf drei Dezimalstellen. 4.5 Membranfilter, Porenweite 0,2 m. 4.6 Zentrifuge. 4.7 Rotations-Vakuumverdampfer. 4.8 Mechanisches Schttelgert oder Magnetrhrgert. 4.9 Aminosurenanalysator oder HPLC-Anlage mit Ionenaustauschsule, einer Vorrichtung fr Ninhydrin, Nachsulenderivatisierung und photomet
45、rischem Detektor. Die Sule ist mit sulfonierten Polystyrenharzen gefllt, die in der Lage sind, die Aminosuren voneinander und von anderen ninhydrinpositiven Materialien zu trennen. Die Strmung in den Leitungen fr Pufferlsung und Ninhydrin wird durch Pumpen erzeugt, die eine Strmungsstabilitt von 0,5
46、 % sowohl whrend des Standard-Kalibrierlaufs als auch whrend der Probenanalyse aufweisen. Bei einigen Aminosurenanalysatoren drfen Hydrolyseverfahren angewendet werden, bei denen das Hydro-lysat eine Natriumkonzentration c = 0,8 mol/l hat und die gesamte restliche Ameisensure aus dem Oxidationsschri
47、tt enthlt. Andere ergeben keine befriedigende Trennung bestimmter Aminosuren, wenn das Hydrolysat berschssige Ameisensure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen enthlt. In diesem Fall ist das Volumen der Sure durch Abdampfen nach der Hydrolyse und vor der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 5 ml z
48、u reduzieren. Das Abdampfen muss unter Vakuum bei einer Hchsttemperatur von 40 C erfolgen. 5 Durchfhrung 5.1 Vorbereitung der Analysenprobe Die Probe ist so fein zu mahlen, bis sie durch ein 0,5-mm-Sieb hindurchgeht. Proben mit hohem Feuchtig-keitsgehalt mssen vor dem Mahlen entweder bei einer Temperatur von nicht ber 50 C luftgetrocknet oder gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt mssen vor dem Mahlen mit Leichtbenzin (3.6) extrahiert werden. EN ISO 13903:2005 (D) 8 5.2 Bestimmung der freien Aminosuren in Futtermitteln und Vormischungen Von der vorbereiteten Analysenprobe (
