1、研究生入学考试生物化学（蛋白质）历年真题试卷汇编 10 及答案与解析1 (上海交通大学 2006 年考研试题)在一个筛选程序中探测到一个迁移率异常的Hb。胰蛋白酶消化后的指纹分析显示在 链内发生了一个氨基酸的取代：正常的氨基端(胰蛋白酶酶切产物，其氨基端第一残基是 Val)八肽(Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys)不见了，代之以一个新的六肽。(1) 哪些氨基酸取代符合上述观察到的现象?(2)给出部分密码表如表所示，编码上述正常(p 链氨基端)八肽的 DNA 序列为GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAG，此序列中哪些单碱基突变可造成这样的氨基酸取代?(3)这
2、个(突变的)Hb 与 HbA 和。HbS 比较(pH8)，(如朝负极泳动)三者的电泳迁移率有什么区别?2 (四川大学 2007 年考研试题)许多埋在膜内的蛋白(内在蛋白)与细胞中的蛋白质不同，它们几乎不可能从膜上转移至水溶液中。然而，此类蛋白的溶解和转移，常可用含有十二烷基硫酸钠或其他的去污剂，例如胆酸的钠盐等溶液来完成，这是什么道理?3 (四川大学 2007 年考研试题)有一蛋白质样品，经：PAGE(2 种 pH 条件下)Westernblot(免疫印迹 )，梯度凝胶电泳分析均显示单一蛋白质着色带；经 HPLC和 Sephadex200 分子筛层析均显示单一蛋白对称洗脱峰，相对分子质量为24
3、0000；在非还原条件下，进行 SDS-PAGE 显示 1 打蛋白着色带，相对分子质量为 120000，还原条件下，显示 1 条蛋白着色带，相对分子质量为 60000；但经IEF 却发现为弥散的一组蛋白着色带(pI3060)，请根据以上试验结果分析其此蛋白质均一性如何? 此蛋白质的结构和组成如何?4 (四川大学 2007 年考研试题)在生物大分子(蛋白质、酶和核酸等)的分离纯化过程中，为了防止其变性失活，应采取哪些措施或注意哪些问题?5 (四川大学 2006 年考研试题)今有以下四种蛋白质的混合物：分子量50000，pI=10；分子量 72000，pI=35； 分子量 31，000，pI=7；
4、分子量12000，pI=5，用中性盐梯度洗脱时，若不考虑其他因素：(1)当它们流过 DEAE 一纤维素阴离子交换柱；(2)流经 SephadexG-100 凝胶过滤柱时，这些蛋白质的洗脱顺序如何?6 (四川大学 2006 年考研试题)根据蛋白质的一级结构序列可以预测蛋白质的空间结构。假设有下列氨基酸序列：Ile 1 一 Ala-His-Thr-Tyr5-GlyPro-PheGlu-Ala10 一Ala-MetCys-Lry15-Glu-Ala-Gln-Pro-Asp20-Gly-MetGlu-CysAla25-Phe-His-Arg。(1)预测在该序的哪一些部位可能会出现 -Turn?(2)何
5、处可能会形成链内二硫键?7 (吉林大学 2009 年考研试题)何为必需氨基酸、非必需氨基酸?哪些氨基酸对人体是必需氨基酸?8 (吉林大学 2009 年考研试题)凝胶过滤层析法分离蛋白质的原理是什么?肌红蛋白、过氧化氢酶、细胞色素 C、肌球蛋白、糜蛋白和血清蛋白的分子量分别为：16900、247500、13370、524800、23240 和 68500，指出从凝胶过滤层析柱上洗脱这些蛋白质的顺序。9 (吉林大学 2009 年考研试题)已知某八肽其氨基酸组成为：Lys，Glu，Ser，Gly，Ala，Met ，Trp 和 Arg。(1)此肽与 FDNB 试剂反应得 DNP-Gly；(2)此肽经糜
6、蛋白酶降解后，产物为两个四肽，其中一个组成为Ser，Met，Lvs ，Glu，此四肽与 FDNB 试剂反应后得 DNP-Glu；(3) 此肽胰蛋白酶降解后可得到两个二肽和一个四肽，其中一个二肽被溴化氰处理后，游离出自由的Ser。请列出八肽的全顺序(N 末端至 C 末端)，并简述你的推知过程。10 (东北师范大学 2008 年考研试题)维持蛋白质空间结构的因素有哪些?根据这些因素解释可逆变性和不可逆变性?11 (东北师范大学 2008 年考研试题)什么是电泳? 电泳技术用于分离鉴定生物大分子的原理是什么? 列举你所知道的电泳种类，并比较各自的优缺点。以聚丙烯酰胺凝胶电泳为例，写出检验糖苷酶纯度的
7、实验步骤。12 (哈尔滨工业大学 2008 年考研试题)分离和纯化蛋白质是根据其在溶液中的哪些性质?13 (哈尔滨工业大学 2007 年考研试题)分离和纯化蛋白质的机理是什么?14 (哈尔滨工业大学 2007 年考研试题)蛋白质结构与功能的关系?15 (山东大学 2006 年考研试题)对于给定蛋白质样品如何进行氨基酸序列测定?16 (山东大学 2006 年考研试题)蛋白质电泳基本原理及影响电泳速度的_丰要因素。17 (山东大学 2006 年考研试题)试述从细胞初提物中分离纯化某一特定蛋白质的基本原理和主要方法。18 (山东大学 2005 年考研试题)某九肽组成为两个 GIy，两个Phe，Tyr
8、、Met、Asp、Arg 和 Pro，经胰乳蛋白酶水解得五肽和四肽，四肽组成为Phe、Tyr、Gly 、Pro ，此九肽的 CNBr 处理产物经阳离子交换树脂层析并洗脱得一组成为 Arg、Phe、Gly 的三肽，此九肽经胰蛋白酶水解得 Phe，如用 FDNB 反应后在水解测得 DNP-Tyr，请写出此九肽顺序。19 (山东大学 2005 年考研试题)说明等电聚焦技术的基本原理。20 (山东大学 2005 年考研试题)举出 5 种重要的氨基酸侧链功能团(化学结构式，功能团名称，各归属于何种氨基酸)。21 (华东理工大学 2007 年考研试题)有一种蛋白质分子在 pH7 的水溶液中可折叠成球状，通
9、常是带极性侧链的氨基酸位于分子外部，带非极性侧链的氨基酸位于分子内部，请回答：(1)在 Pro、Met、Glu、Lys、lle 和 His 中哪些位于分子内部，哪些位于分子外部?(2)为什么在球蛋白内部和外部都能发现 Gly 和 Ala?(3)Ser、Thr、Asn 和 Gln 都是极性氨基酸，为什么会在分子内部发现?22 (华东理工大学 2007 年考研试题)在一抽提液中含有三种蛋白质，其性质如下：蛋白质相对分子质量等电点A2000085B2100059C500060试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。23 (华东理工大学 2007 年考研试题)试举例说明色谱(chromatography
10、)技术在蛋白质化学中的主要用途。24 (华东理工大学 2007 年考研试题)自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多，没有蛋白质也就没有生命，试述蛋白质的功能多样性及其意义。25 (华中农业大学 2010 年考研试题)有两个纯的蛋白质 a 和 b，分子量都是 100000的近似球形的蛋白质。其中，蛋白质 a 由 2 个分子量为 40000 的亚基和 2 个分子量为 10000 的亚基组成的四聚体，该蛋白质的等电点 pI=60；蛋白质 b 由分子量为25000 的单一亚基组成的四聚体，该蛋白质的等电点也是 pI=60。试预测这两种蛋白质在 PAGE 和 SDS-PAGE 电泳系统中
11、的电泳结果。26 (华南农业大学 2009 年考研试题)今有以下四种蛋白质的混合物：(A)相对分子质量 12000，pI10；(B) 相对分子质量 62000，pI4；(C)相对分子质量28000，pI7 ；(D) 相对分子质量 9000，pI5 。若不考虑其他因素，当它们：(1)流过DEAE纤维素阴离子交换柱，用缓冲液 pH88 和线性 NaCl 盐梯度洗脱时；(2)流经 SephadexG-75 凝胶过滤柱时，这些蛋白质的洗脱顺序如何? 并简单说明原因.27 (华中师范大学 2010 年考研试题)简述 23 种蛋白质分析纯化的常用技术和大致步骤。28 (湖南大学 2007 年考研试题)试述
12、 Wetem 印迹法分析用于研究蛋白质的基本原理和主要步骤。29 (中科大 2009 年考研试题)球蛋白的四个结构层次。30 (中科大 2009 年考研试题)大多数蛋白质在 280nm 处具有特征吸收峰的化学基础。研究生入学考试生物化学（蛋白质）历年真题试卷汇编 10 答案与解析1 【正确答案】 (1)主要有以下氨基酸取代：Glu 6 变为 Arg，Lys；His 2 变为Arg，Lys ，因胰蛋白酶切割羰基端为 Arg 或 Lys 的肽链。 (2)可造成这样氨基酸取代的单碱基突变是 G16 变为 A，使 Glu 变为 Lys。因为其他单碱基突变不会导致氨基酸的改变而发生取代。 (3)这个(突
13、变的)Hb 与 HbA 和 HbS 的电泳迁移率：HbXHbSHbA，根据肽链带电情况。HbA 是正常成人血红蛋白，HbS 是镰刀形红细胞贫血患者的异常血红蛋白，其 链节 6 位谷氨酸为缬氨酸取代。 HbX 中Glu6 变为 Arg，Lys；His 2 变为 Arg，Lys，带负电的氨基酸变为带正电荷的氨基酸，而 HbS 中 Glu 变为 Val，带负电的氨基酸变为不带电荷的氨基酸。由于电泳朝负极泳动，所以电泳迁移率：HbXHbSHbA。【知识模块】 蛋白质2 【正确答案】 十二烷基硫酸钠和胆酸的钠盐等去污剂，都具有亲水和疏水两部分，它们可以破坏蛋白与膜之间的疏水相互作用，并用疏水部分结合蛋白
14、的疏水部分，亲水部分向外，形成一个可溶性微团，将蛋白转移到水中。【知识模块】 蛋白质3 【正确答案】 均一，含两条肽链，每个肽链有一个二硫键。【知识模块】 蛋白质4 【正确答案】 在生物大分子(蛋白质、酶和核酸等)的分离纯化过程中，为了防止其变性失活，应采取的措施或注意的问题：整个纯化过程，保持低温条件，通常在46；适宜的 pH 缓冲液，避免过酸和过碱条件；尽量避免长时间暴露于空气中；必要时可在提取液中加蛋白水解酶的抑制剂，避免目的蛋白被降解；必要时加稳定剂和保护剂或加微生物抑制剂等；避免剧烈搅拌；对提取所用用具要进行特殊处理，如提取 mRNA 时，对所用用具要进行烘烤或 DEPC 处理等。【
15、知识模块】 蛋白质5 【正确答案】 (1)用 DEAE-纤维素阴离子交换柱分离蛋白质，在一定的 pH 条件下，等电点 pIpH 的蛋白质带正电，不能与阴离子交换剂结合；等电点 pIpH的蛋白质带负电，能与阴离子交换剂结合，一般 pI 越大的蛋白质与阴离子交换剂结合力越弱，首先被洗脱下来。比较 4 种蛋白质的等电点 pI： 。所以，当它们流过 DEAE-纤维素阴离子交换柱，洗脱顺序为 。(2)凝胶过滤是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，因此大分子先流出来，小分子后流出来。比
16、较这4 种蛋白质的分子量： 。所以，流经 Sephadex G100 凝胶过滤柱时，洗脱顺序为。【知识模块】 蛋白质6 【正确答案】 (1)蛋白质分子多肽链在形成空间构象的时候，经常会出现 180的回折(转折 )，回折处的结构就称为 -Turn，一般由四个连续的氨基酸组成。在构成这种结构的四个氨基酸中，第一个氨基酸的羧基和第四个氨基酸的氨基之间形成氢键。-Tutn 的特定构象在一定程度上取决于他的组成氨基酸，某些氨基酸如脯氨酸和甘氨酸经常存在其中，由于甘氨酸缺少侧链(只有一个 H)，在 -Turn中能很好的调整其他残基的空间阻碍，因此使立体化学上最合适的氨基酸；而脯氨酸具有换装结构和固定的角，
17、因此在一定程度上迫使 BTurn 形成，促使多台自身回折且这些回折有助于反平行 折叠片的形成。所以在 AA7 和 AA19 位可能形成 一Turn。(2)二硫键是一类在蛋白质肽链的两个半胱氨酸(Cys)之间形成的共价键，因为半胱氨酸上含有巯基。在该氨基酸序列上，AA13 和 AA24 为半胱氨酸(Cys) ，所以在这两个半胱氨酸之间可能形成二硫键。【知识模块】 蛋白质7 【正确答案】 机体维持正常生长所必需而又自己不能合成，需从外界获取的氨基酸称为必需氨基酸。凡机体能自己合成的氨基酸称为非必需氨基酸。人体必需的氨基酸有苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸
18、和精氨酸 10 种(回答 8 种以上即可)。【知识模块】 蛋白质8 【正确答案】 凝胶过滤层析的原理是，当不同分子量的蛋白质混合物流经层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构中，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最后流出柱外；而比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。从凝胶过滤层析柱上洗脱这些蛋白质的先后顺序是：肌球蛋白、过氧化氢酶、血清蛋白、糜蛋白酶、肌红蛋白、细胞色素 C。【知识模块】 蛋白质9 【正确答案】 由条件(1)可知，N 末端的氨基酸残基为 Gly；由条
19、件(2)可知，糜蛋白断裂 T 叩羧基形成的肽键，且四肽产物 N 末端氨基酸残基为 Glu，所以 4、5位氨基酸残基分别为 Trp，Gly；由条件(3) 可知，胰蛋白酶断裂 Lvs，Arg 羧基形成的肽键，结合条件(2)中给出的四肽组成，判断八肽为 Gly-Arg-Ala-Trp-GluLysX-X，溴化氰断裂 Met 羧基形成的肽键，所以二肽为 Met-Ser。综合分析可知，此八肽为：Gly-Arg-Ala-Trp-Glu-Lys-Met-Ser。【知识模块】 蛋白质10 【正确答案】 (1)蛋白质的分子结构包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，其中，维持一级结构的主要因素是肽键、二硫键
20、；维持二级结构的主要因素是氢键；维持三级结构的主要因素是疏水键、离子键、氢键和范德华力等；维持四级结构的主要因素是疏水作用，其次是氢键和离子键。(2)蛋白质变性分为可逆变性和不可逆变性两类：有的蛋白质变性后如设法将变性剂除去，该变性蛋白尚能恢复其天然构象和生物学活性，这一现象称为蛋白质的复性，又称可逆变性，可逆变性一般只涉及蛋白质分子的四级结构和三级结构的变化，即疏水键、离子键、氢键和范德华力等被破坏；大多数蛋白质的可逆变性条件可能很复杂，许多蛋白质变性后空间结构破坏严重而不能复性，此种情况称为不可逆变性，不可逆变性时二级结构也发生了变化，即氢键断裂，破坏了肽键特定的排列，内部的一些非极性基团
21、暴露到了分子表面，促进了蛋白质分子之间的相互结合而发生不可逆变性。【知识模块】 蛋白质11 【正确答案】 (1)带电的胶粒或大分子在外加电场中向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法即为电泳技术。 (2)电泳技术的基本原理是，生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的 pH 及其组成，由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。pHpI 时，分子带负电荷，在电场中向正极移动；pHpI 时，分子带
22、正电荷，在电场中向负极移动。 (3)按支持介质的不同可分为：纸电泳(Paper electrophorisis)；醋酸纤维薄膜电泳(CelluloseAcetateelectrophoresis)；琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gelelectrophoresis)(PAGE)；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 按支持介质形状不同可分为：薄层电泳；板电泳； 柱电泳。 几种常见电泳的比较如表所示。(4)以聚丙烯酰胺凝胶电泳为例检验糖苷酶纯度的实验步骤：安装夹心式垂直板电泳槽；配胶； 制备凝胶板；
23、加样；电泳； 固定、染色：脱色。【知识模块】 蛋白质12 【正确答案】 分离和纯化蛋白质是根据其在溶液中带电性质和胶体性质。利用带电性质可包括等电点分离纯化法、电泳分离纯化法、盐析法等；利用胶体性质是指蛋白质相对分子质量很大，直径处在胶体范畴内，能通过透析等方法进行分离纯化。【知识模块】 蛋白质13 【正确答案】 (1)分离和纯化的依据。不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，其立体结构不同，物化性质不同，利用不同蛋白质的不同特性，可以将其进行分离和纯化。1)蛋白质的酸碱性质。蛋白质是两性电解质，也有等电点，即所带净电荷为零的pH 值。多数蛋白质等电点为中性偏酸，约 5 左右。偏酸的如胃蛋白酶，等
24、电点为l 左右；偏碱的如鱼精蛋白，约为 12；蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最小，易聚集沉淀。同时其黏度、渗透性、膨胀性以及导电能力均为最小；蛋白质的滴定曲线形状和等电点在有中性盐存在的情况下，可以发生明显的变化。观察到的等电点在一定程度上决定于介质中的离子组成；没有其他盐类存在下，蛋白质质子供体解离出的质子与质子受体结合的质子数相等时的 pH 称为等离子点。等离子点对每种蛋白质是一个常数。2)蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀。蛋白质是一种分子胶体，具有胶体溶液的性质。利用半透膜可分离纯化蛋白质，称为透析；多数球状蛋白表面分布有很多极性基团，易形成水化层，一般每克蛋白可吸附 03 到 05
25、克水；分子表面的可解离基团可与周围的反离子构成稳定的双电层，增加蛋白质的稳定性；蛋白质不在等电点时具有同种电荷，互相排斥，因此在等电点时易沉淀。3)蛋白质分子的大小与形状。蛋白质分子的大小从几百到一百万，一般为10000150000，电泳时的迁移率、透析、超滤等都取决于蛋白质分子的大小。球型、雪茄型的蛋白质在电泳、梯度离心、层析时摩擦阻力、扩散速度不同。因此蛋白质分子的大小与形状也是蛋白质分离和纯化的重要依据。(2)蛋白质提纯的总目标：增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。(3)蛋白质分离纯化的基本原则：选择好的材料；了解目的蛋白质的稳定性
26、；探索有效的抽提法和浓缩法；建立一套层析的组合；以较好的方法贮存。(4)蛋白质分离纯化的步骤及具体方法。 初(粗)提：组织、细胞破碎；缓冲液提取；粗分级分离 (粗纯化 )：盐析，有机溶剂沉淀，等电点沉淀，超滤浓缩等：细分级分离(精纯化)：分子筛层析，亲和层析，疏水反相层析，离子交换层析，吸附层析，电泳等；结晶。【知识模块】 蛋白质14 【正确答案】 (1)蛋白质一级结构与功能的关系。 1)一级结构是空间构象的基础。例如，RNase 是由 124 氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个 Cys 的-SH 构成 4 对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质分子。在蛋白质变性剂(如 8molL 的尿素
27、)和一些还原剂( 如巯基乙醇)存在下，酶分子中的二硫键全部被还原，酶的空问结构破坏，肽链完全伸展，酶的催化活性完全丧失。当用透析的方法除去变性剂和巯基乙醇后，发现酶大部分活性恢复，所有的二硫键准确无误地恢复原来状态。若用其他的方法改变分子中二硫键的配对方式，酶完全丧失活性。这个实验表明，蛋白质的一级结构决定它的空间结构，而特定的空间结构是蛋白质具有生物活性的保证。2)蛋白质一级结构决定其高级结构，冈此最终决定了蛋白质的功能。例如，84 个氨基酸的胰岛素原(proinsulin)，胰岛素原也没活性，在包装分泌时，A、B 链之间的 33 个氨基酸残基被切除，才形成具有活性的胰岛素。 3)功能相似的
28、蛋白质往往能显示它们在进化上的亲缘关系：比较不同来源的细胞色素 C 发现，与功能密切相关的氨基酸残基是高度保守的，这说明不同种属具有同一功能的蛋白质，在进化上来自相同的祖先，但存在种属差异。不同种属间的同源蛋白质一级结构上相对应的氨基酸差别越大，其亲缘关系愈远，反之，其亲缘关系愈近。 4)许多疾病都是由于相关蛋白质结构异常引起的。基因突变导致蛋白质一级结构改变而产生的遗传病。称之为分子病。例如，镰刀型贫血症是由于血红蛋白的 p亚基上的第六位氨基酸由谷氨酸变成了缬氨酸，导致血红蛋白的结构和功能的改变，其运输氧气的能力大大地降低，并且红细胞呈镰刀状。 所以，蛋白质一定的结构执行一定的功能。功能不同
29、的蛋白质总是有着不同的序列；比较种属来源不同而功能相同的蛋白质的一级结构，可能有某些差异，但与功能相关的结构也总是相同的。若一级结构变化，蛋白质的功能可能发生很大的变化。 (2)蛋白质的空间结构与功能的关系。各种蛋白质都有特定的空间构象，而特定的空间构象又与它们特定的生物学功能相适应，蛋白质的结构与功能是高度统一的。 例如，Hb 与 O2 结合后，Hb 的构象发生变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能。像血红蛋白这种具有变构效应的蛋白质称为变构蛋白(allosteric protein)。血红蛋白的这种变构效应能更有效地行使其运氧的生物学功能。【知识模块】 蛋白质15 【正
30、确答案】 测定多肽链的数目；拆分蛋白质分子的多肽链；断开二硫键；分析每一多肽链的氨基酸组成；鉴定多肽链的 N 和 C 端；裂解多肽链成较小的片段；测定各肽端的氨基酸序列，重建完整多肽链的一级结构；确定肽氨酸链桥的位置。【知识模块】 蛋白质16 【正确答案】 (1)蛋白质电泳基本原理。 蛋白质是一种两性电解质，它同时具有游离氨基和羧基。每种蛋白质都有它自己的等电点。等电点的高低取决于蛋白质的性质，在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。在 pH 大于等电点溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。反之，在pH 小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在
31、电场中向负极移动。 这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度，取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的 pH 值、黏度以及电渗等因素。 (2)影响电泳的因素。 不同带电质点在同一电场中的迁移率(或泳动度)不同，影响迁移率的因素有： 1)带电质点的性质。颗粒所带净电荷的量，颗粒大小及形状等。带电荷越多，分子越小，泳动速度越快。 2)电场强度。电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大，带电质点泳动速度越快。反之亦然。 3)溶液中 pH 值。溶液的 pH 值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解
32、质而言，pH 值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。反之则越慢。蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用 pH8288 的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种 pH 中，血清蛋白一般都带负电荷。 4)溶液的离子强度。溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。血清电泳一般最适宜离子强度在 00250075 之间。离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。 5)电渗作用。电渗是在电场中液体对于固
33、体支持物的相对移动。由于琼脂中含有 SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的 球蛋白就是如此。 6)吸附作用。即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象而降低了分辨率。纸的吸附作用最大，醋酸纤维膜的吸附作用较小或无。 7)电泳时间，电泳时间与迁移率成正比。【知识模块】 蛋白质17 【正确答案】 从细胞初提物中分离纯化某一特定蛋白质包括粗分级分离、细分级分离。(1)粗分级分离。当蛋白质提
34、取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。(2)细分级分离。样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高
35、。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。【知识模块】 蛋白质18 【正确答案】 胰凝乳蛋白酶断裂 Phe、Trp 和 Tyr 的羧基端，N 端有 Pro 时不裂解，且 FDNB 结果得知 N 端为 Tyr，所以 N 端前四个为 Tyr-Pro-Gly-Phe；CNBr专一裂解 Met 羧基所成的肽键，此九肽经 CNBr 处理产物经阳离子
36、交换树脂层析并洗脱得一组成为 Arg、Phe、Gly 的三肽，所以可以推出此九肽的第五和六位是 Asp和 Met；胰蛋白酶专一断裂 Lvs，Arg 的羧基侧肽键，而此九肽经胰蛋白酶水解得Phe，所以最后三位是 GlyArgPhe。综合分析，可知此九肽顺序为。Tyr-Pro-Gly-Phe-Asp-Met-Gly-Arg-Phe。【知识模块】 蛋白质19 【正确答案】 等电聚焦技术是在稳定的 pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法，是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，其基本原理是：在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的
37、pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为 0 的区带，这时的 pH 则是该分子的 pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于 pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向 pI 迁移，因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在等于其 pI 的 pH 梯度处得以“聚焦” ，并形成一个很窄的区带。【知识模块】 蛋白质20 【正确答案】 (1)化学结构式：-SH；功能团名称：巯基；归属于的氨基酸：半胱氨酸(Cys)。 (2)化学结构式：一 OH；功能团名称：羟基
38、；归属于的氨基酸：丝氨酸(Ser)。 (3) 化学结构式：一 COOH；功能团名称：羧基；归属于的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。 (4) 化学结构式为： 功能团名称：苯环；归属于的氨基酸：苯丙氨酸(Phe)。 (5) 化学结构式：NH 2；功能团名称：氨基；归属于的氨基酸：精氨酸(Arg) 。【知识模块】 蛋白质21 【正确答案】 (1)Pro、Met、lle 是带非极性侧链的氨基酸，位于分子内部；Glu、Lys、His 是带极性侧链的氨基酸，位于分子外部。 (2)因为 Gly 和 Ala 的侧链都比较小，疏水性和极性都小，Gly 只有一个 H+与 C 原子相连，Ala 只有一
39、CH3 与 -C原子相连，所以在球蛋白内部和外部都能发现它们。 (3)因为Ser、Thr、Asn 和 Gln 在 pH 70 时其极性侧链不带电荷，能参与分子内部氢键的形成，氢键减少了它们的极性，所以会在分子内部发现它们。【知识模块】 蛋白质22 【正确答案】 因为蛋白质 A 与 B 的相对分子质量相差较小，蛋白质 B、C 的等电点相差较小，所以不能通过。步分离纯化这三种蛋白质。首先，由于蛋白质 C与 A、B 的相对分子质量相差较大，可先用凝胶过滤的方法分离纯化出蛋白质 C，并得到 A、B 蛋白质混合物。而蛋白质 A 与 B 等电点不同，再用离子交换柱层析分离纯化出蛋白质 A 与 B。【知识模
40、块】 蛋白质23 【正确答案】 色谱(chromatography)技术最早是俄国植物学家 Michael Tswett 在1906 年将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名。色谱技术是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。凝胶色谱是一种常用的分离蛋白质的方法，是根据分子大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，按分子大小将样品中各组分分开。大分子主要是从凝
41、胶颗粒之间的空隙通过，路线相对较短先被洗脱；小分子从小孔内穿过，增加了分离时所走的路程而后被洗脱。【知识模块】 蛋白质24 【正确答案】 (1)构造、更新、修补功能：蛋白质是一切生命的物质基础，是肌体细胞的重要组成部分，细胞在代谢中蛋白质的更新以及细胞分裂、个体成长都必须要蛋白质的供给和补充。各种因素造成细胞破损、组织创伤时，也需要蛋白质作为修补的原料。(2)催化、调节功能：物质代谢依靠生物催化酶。已知的二千多种酶的化学本质都是蛋白质。除酶以外，还需要一些调控物质来控制各种代谢途径的相互配合，使其成为一个完整的生命活动过程。其中许多调控物质，如胰岛素、生长素、胸腺素和多种促激素的化学本质也是蛋
42、白质。(3)转运、储存功能：体内一些小分子物质和疏水性物质的转运主要靠血液中特异的蛋白质来转运的。肝脏中的铁离子以铁蛋白复合体的形式储存。(4)运动、支持作用：生物体的一切活动都伴有肌肉的收缩和舒张，都是由肌动蛋白和肌球蛋白等相互作用来完成。皮肤、骨骼和肌腱的胶原纤维主要含有胶原蛋白，它具有强烈的韧性，从而保证这些组织的功能。(5)免疫、保护功能：生物体的免疫功能与抗体有关，而抗体是一类特异的球蛋白，对细菌、病毒和异体蛋白有高度的识别能力，并与之结合使其失活，从而保护生物体的正常机能状态。(6)生长、繁殖功能：生物的生长、繁殖、遗传和变异都与核蛋白有关。核蛋白是核酸和蛋白质组成的结合蛋白质，由
43、组蛋白和阻遏蛋白来控制调节。(7)载体、受体：存在于生物膜上起着转运物质和传递信息的蛋白质，载体将胞外物质送入胞内；受体将信息带入胞内。(8)氧化供能功能：体内组织蛋白质分解为氨基酸后，经脱氨基作用生成 -酮酸，后者参加三羧酸循环氧化分解，释放能量。【知识模块】 蛋白质25 【正确答案】 聚丙烯凝胶为三维网状结构，具有分子筛作用，在聚丙烯凝胶电泳(PAGE)的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。由于蛋白质 a 和 b 都是纯的蛋白质，分子量都是 100000，所以这两种蛋白质在 PAGE 电泳系统中的电泳结果都是在 Mr=1
44、00000 处有一个条带。 SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)是在 PAGE 系统中引入 SDS 这种阴离子去污剂，能使蛋白质变性，蛋白质的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小。蛋白质 a 由 2 个分子量为 40000 的亚基和 2 个分子量为10,000 的亚基组成的四聚体，所以蛋白质 a 在 SDSPAGE 电泳系统中的电泳结果为在 Mr=40000 处有一个条带，在 Mr=10,000 处也有一个条带。蛋白质 b 由分子量为 25000 的单一亚基组成的叫聚体，所以蛋白质 b 在 SDS-PAGE 电泳系统中的电泳结果为仅在 Mr=25000 处有一个条带。【知识模块】 蛋白质
45、26 【正确答案】 (1)在 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析中，蛋白质有不同的 pI，在同一 pH 下，各种蛋白质所带的电荷的种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用的强弱不同。带负电荷少，吸附能力弱的先洗脱下来，带负电荷多，吸附能力强的后洗脱下来，从而将蛋白质混合物分开，据此分析可知四种蛋白质的洗脱顺序为：(A)、 (C)、(D)、(B)。(2)在 Sephadex G-75 凝胶过滤柱时，小颗粒(小分子质量)进入凝胶的孔内扩散，流动速度慢，后洗脱；大颗粒(大分子量)不进入凝胶的孔内，滑动速度快，先洗脱。据此分析可知四种蛋白质的洗脱顺序为：(B)、(C)、(A)、(D) 。【知识模块】
46、蛋白质27 【正确答案】 蛋白质的分离纯化方法：根据分子大小的不同，有透析或超滤、离心沉淀凝胶过滤层析等技术；根据蛋白质溶解度的不同，有等电点沉淀、盐析(常用硫酸铵) 、有机溶剂沉淀等技术； 根据电离性质的不同，有电泳、离子交换层析等技术；根据蛋白质特异亲和力的不同，有亲和层析技术。(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳。其原理是聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。大致步骤：准备电泳槽、电泳仪；凝胶制备； 灌胶；样品预处理和加样；电泳。(2)离子交换层析法 (IEC)。是从复杂的混合物中，
47、分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和 pH 值，物质就能依次从层析柱中分离出来。离子交换层析法大致分为五个步骤：离子扩散到树脂表面；离子通过树脂扩散到交换位置； 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其他离子取代；被交换的离子扩散到树脂表面； 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。【知识模块】 蛋白质28 【正确答案】 Wetern 印迹是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的鞘上发展起来二项检测蛋白质的技术。它将 SDS
48、丙烯酰胺凝肢电泳的高分辨力与抗原抗体的特异性相结合，综合了 SDS-PAGE 的高分辨力和 ELISA 法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段。典型的印迹实验包括三个步骤：蛋白质的电泳分离； 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。第一阶段为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。抗原等蛋白样品经 SDS 处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳
49、动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压(100V)和大电流 (1 2A)，通电 45 分钟转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的 HRP 底物为 3，3-二氨基联苯胺(呈棕色)和 4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据 SDS-PAGE 时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。【知识模块】 蛋白质29 【正确答案】 球蛋白的四个结构层次：(1)一级结构，氨基酸序列，包含蛋白质全部的交给信息，决定其他不同层次的结构形式；(2)二级结构，包括多肽链主链肽段的规则构象及不规则构象。-螺旋含量高的蛋白质，一般是紧密而稳定的，不易变化，所以活性部位不会位于 -螺旋区域。含 -折叠多的蛋白质，其构象的紧密程度及稳定
