1、第3节 聚合酶链式反应技术,1.记住PCR技术的原理。 2.简述PCR技术的基本操作。 3.说出PCR技术的应用。,一,二,三,一、DNA片段的扩增 1.概念 PCR技术是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法。 2.扩增条件 按照DNA复制所需条件,在体外酶促合成DNA时,必须具备待扩增的目的DNA(DNA合成的模板)、合成DNA时所需的特异引物和原料4种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、起酶促作用的耐热Taq DNA聚合酶和作为反应介质的缓冲溶液。,四,一,二,三,3.原理 根据DNA的理化特性,在高温条件下,双链DNA解旋变为单链DNA(变性);低温条件下单链DN
2、A又可恢复为双链DNA(复性);中温条件下能进行DNA合成,使DNA链延伸。由此,PCR反应过程一般采取“高温变性低温复性中温延伸”三个步骤,促使DNA进行复制。以上述反应作为一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,得到大量的目的DNA片段。,四,一,二,三,四,二、琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便的快速分离、纯化和鉴定DNA的方法。琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小,因此 大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。,一,二,三,四,三、D
3、NA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳的方法步骤 1.DNA片段的PCR扩增 (1)把PCR反应体系的各种药品加入冰浴的EP管中,混合均匀后 低速离心。每管加入30 L无菌石蜡油。 (2)将EP管放入PCR热循环仪中,输入并运行反应程序。 2.扩增产物的检测 制作电泳胶板加样电泳观察。,一,二,三,四,四、PCR影响因素 在PCR实验中,需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间,片段较大,中温延伸的时间就要相应延长;引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择,如果引物越短,A、T含量越多,PCR反应的复性温度就越低,反之引物长度较长,G、C含量较高,则需要设计较高的复性温度。Taq DNA聚合酶在PC
4、R扩增过程中也存在大约为110-5的出错概率,而且随着循环数的增加,其活性也逐渐降低。因此,PCR扩增循环次数并非越多越好,一般控制在2535个循环。,一,二,三,四,思考： 2014年埃博拉疫情在非洲蔓延,随后生物科学研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒检测试剂盒,使得能够快速诊断出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒检测试剂盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎样获得的呢? 提示:采用PCR技术对埃博拉病毒的基因迅速扩增产生的。,1.PCR技术与DNA的复制 PCR反应通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制,所以PCR反应与DNA复制的原理相同,计算方法也大体相同。例如:PCR
5、反应中的目的片段一般以2n的方式积累,其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。,2.PCR的常见问题 PCR实验很容易出现假阳性(检测出非目的片段的扩增,而未检测出目的片段的扩增)或假阴性(未检测出任何片段的扩增)的结果。 PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增,因此模板DNA的污染是PCR出现假阳性结果的主要原因。此外,样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果,PCR操作时要注意做到隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头等。,出现假阴性结果的常见原因有Taq D
6、NA聚合酶活力不够或其活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关、PCR系统的建立欠妥当及循环次数不够,等等。当实验中出现假阴性的情况时,应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶,并增加510次循环。为了防止假阴性结果的出现,在选用Taq DNA聚合酶时,要注意用活力高、质量好的酶。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高,但也不允许有机试剂的污染。所以,在提取DNA模板时,应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低,很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况,尤其需要保证引物的3端与靶基因互补。,PCR的原理及应用 【例题1】
7、 下列有关PCR的描述,不正确的是( ) A.是体外酶促合成特定DNA片段的一种技术 B.引物一般采用人工合成的单链DNA片段 C.PCR产物以指数方式增加 D.扩增对象是氨基酸序列 解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,以四种三磷酸脱氧核苷酸为原料,在引物的作用下使DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸,短时间迅速复制上百万倍的DNA片段,其扩增产物以指数方式增加。 答案:D,题型一,题型二,【例题2】 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步,这三大步需要的温度依次是( ) A.94 、40 、72 B.72 、40 、94 C.40 、94 、
8、72 D.80 、40 、72 解析:当温度上升到9498 时,双链DNA变性成单链,称之为变性;当温度迅速下降到4060 时,引物通过碱基互补配对与单链DNA结合;当温度上升到72 左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,称为延伸。 答案:A,题型一,题型二,题型一,题型二,解析:从土壤中分离微生物的一般流程是土壤取样制备培养基分装制备土壤稀释液接种培养观察。该实验步骤没有问题,但在前五步操作中都没有进行无菌操作,因而无法说明分解纤维素的微生物一定来自于土壤。 答案:(1)取样工具应提前灭菌;不能用蒸馏水,应用无菌
9、水;该操作应在火焰旁进行。 (3)培养基分装并加滤纸条后应灭菌。 (4)在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁。 (5)接种应在无菌条件下进行。,题型一,题型二,PCR基本操作与产物测定 【例题3】 在PCR实验操作中,下列说法不正确的是 ( ) A.在扩增产物的检测中需配制质量分数为10%的琼脂糖凝胶,制成电泳胶板 B.离心管的盖子一定要盖严,防止液体外溢 C.在检测时,需将胶板浸入溴化乙锭溶液染色510 min D.离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果 解析:在扩增产物的检测中,需配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶,制作成电泳胶板。 答案:A,1,2,3,4,1.有关PCR技
10、术,下列叙述不正确的是( ) A.用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸 B.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似 C. PCR反应只需一定的缓冲溶液和DNA模板以及四种三磷酸脱氧核苷酸 D. PCR一般经历2530个循环,每个循环分为变性、复性、延伸 答案:C 解析:PCR反应中需要的条件有模板(DNA分子)、原料(4种三磷酸脱氧核苷酸)、酶(耐高温DNA聚合酶)、引物和一定的缓冲液等。,5,6,1,2,3,4,2.引物的作用是( ) A.打开DNA双链 B.催化合成DNA子链 C.使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制DNA D.提供模板 答案:C 解析
11、:DNA分子的复制具有方向性,即只能从引物的3端开始,从子链的5端向3端延伸。引物的作用是与DNA聚合酶结合促使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制DNA。,5,6,1,2,3,4,3.使用PCR仪进行DNA扩增的具体实验操作顺序应为 ( ) 设计好PCR仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在离心管中依次加入各组分 进行PCR反应 离心使反应液集中在离心管底部 A. B. C. D. 答案:C 解析:使用PCR仪进行DNA扩增前,首先按照PCR体系配方,依次将各组分加入离心管离心,使反应液集中于试管底部,然后再设计好PCR仪的循环程序进行PCR反应。,5,6,1,2,3,4,4.利用
12、PCR技术扩增目的基因的过程中,需加入( ) A.耐高温的解旋酶以保证DNA双链完全解开 B.2种已知核苷酸序列的引物以保证核苷酸链的延伸 C.4种足量的核糖核苷酸以保证目的基因的扩增 D.一定量的盐酸和氢氧化钠溶液以维持pH的稳定 答案:B 解析:在PCR过程中,解旋是通过加热到94 实现的,不需要加入解旋酶。PCR过程中以解开的DNA的两条链为模板,因此需要2种已知序列的引物分别与两条模板链结合(注意由于DNA分子的两条链是反向的,2种引物会分别在DNA的两端与互补的模板链结合)。PCR反应的原料是4种三磷酸脱氧核苷酸。反应溶液体系的pH依靠磷酸缓冲液维持稳定。,5,6,1,2,3,4,5
13、,6,5.要使PCR反应在体外条件下顺利地进行,需要严格地控制( ) A.氧气的浓度 B.酸碱度 C.温度 D.大气的湿度 答案:C,1,2,3,4,5,6,6.生物技术的迅速发展,给社会带来了较大的经济效益,受到社会广泛重视。请回答下列生物技术方面的问题。 (1)Taq耐热菌的发现和分离为基因工程的发展作出了突出贡献。从培养液或自然环境分离Taq耐热菌需要在 条件下培养;从Taq耐热菌中分离的 酶是PCR技术的关键酶。 (2)1993年,美国科学家Mullis因发明了PCR技术而获得了诺贝尔化学奖。PCR过程中必需的条件包括DNA聚合酶、模板DNA、能量、4种游离的三磷酸脱氧核苷酸、缓冲溶液和 ;在生物体内复制必需,而在PCR技术中不需要的成分是 。 答案:(1)高温 热稳定DNA聚合 (2)引物 解旋酶,
