1、1基因工程(30 分钟 100 分)1.(8 分)利用基因工程技术培育马铃薯新品种，目前已经取得丰硕成果。请根据所学知识回答下列问题：(1)马铃薯易患多种疾病，导致其产量不高。通过导入抗病基因并使其表达可以提高马铃薯产量，基因工程中使用最多的抗病基因是_和病毒的复制酶基因。 (2)马铃薯是双子叶植物，常用_法将目的基因导入马铃薯受体细胞中。构建好的基因表达载体基本结构包括目的基因、标记基因、_、_、_五部分。(3)科学家还培育出抗除草剂的转基因马铃薯，其设计方法：修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂_(填“敏感”或“不敏感”)，或使靶蛋白过量表达，植物吸收除草剂后仍能_。 (4)将目的基因导入
2、受体细胞后，还需对转基因植物进行_。 【解析】(1)在基因工程中，使用最多的抗病基因是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。(2)常用农杆菌转化法将目的基因导入马铃薯等双子叶植物的受体细胞中。构建好的基因表达载体的基本结构包括目的基因、标记基因、终止子、启动子和复制原点五部分。(3)培育抗除草剂的转基因马铃薯，需通过修饰使除草剂作用的靶蛋白对除草剂不敏感，或使靶蛋白过量表达，使植物吸收除草剂后仍能正常代谢。(4)将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因植物进行目的基因的检测与鉴定。答案：(1)病毒外壳蛋白基因(2)农杆菌转化 启动子 终止子 复制原点(3)不敏感 正常代谢(4)目的基因的检测与鉴定
3、2.(10 分)如图表示从苏云金芽孢杆菌分离出杀虫晶体蛋白基因(简称 Bt 基因)及形成转基因抗虫植物的图解。请分析回答：2(1)写出 b 过程的表达式：_。 (2)人工合成目的基因的方法有： _； _。 (3)将目的基因和载体(质粒)结合的工具酶有_酶和_酶。 (4)科学家计划从哺乳动物的乳汁中提取某种抗体，应将控制抗体合成的基因导入该种动物的_中，导入基因成功表达的标志是_。 【解析】(1)Bt 基因控制晶体蛋白的合成，需要经过转录、翻译两个过程。(2)人工合成目的基因，可以 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，合成 DNA 单链，然后在DNA 聚合酶的作用下，合成目的基因；在目的基因较
4、为短小，且序列已知的前提下，可以直接用 DNA 合成仪合成。(3)将目的基因和载体(质粒)结合，需要用限制酶分别切割目的基因和质粒，以形成相同的黏性末端，然后用 DNA 连接酶进行连接。(4)培育转基因动物应以受精卵为受体细胞，培育成功的标志是在动物乳汁中检测到特定抗体。答案：(1)Bt 基因 mRNA 原毒素(晶体蛋白)(2)以目的基因的 mRNA 为模板反转录为单链 DNA，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成双链DNA 依照蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出基因的碱基序列，然后直接合成目的基因(3)限制性核酸内切 DNA 连接(4)受精卵 动物乳汁中含此种抗体【加固训练】欧洲哥廷根小型猪
5、因其器官大小、结构和生理特点等方面与人的器官极为相似，已经成为国际上理想的异种器官移植的研究材料。目前，欧洲哥廷根小型猪作为糖尿病、心脏病、帕金森氏症等重大人类疾病及新药研究的动物模型，也得到了全世界医药管理机构的认可。(1)异种器官移植到人体内会发生_，从而使外源器官难以存活。为解决这一难题，必须设法除去医用小型猪的_基因，或抑制该基因的_。(2)向小型猪转入外源基因时，其受体细胞通常是_，导入方法是_。(3)要对转基因成功的医用小型猪进行扩大培养，可采用的技术手段是_。3(4)为了获得该动物，需将_基因与_基因的启动子等调控组件重组在一起，构建基因表达载体。【解析】(1)异种器官移植会引起
6、人体发生免疫排斥反应。为解决此问题，需除去小型猪体内表达抗原的基因，或抑制该抗原基因的表达。(2)基因工程中常用的动物受体细胞是受精卵，因为受精卵全能性高，通常采用显微注射技术将目的基因导入受精卵。(3)对转基因成功的小型猪扩大培养，可采用克隆(核移植)技术。(4)获得该种动物需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，构建基因表达载体。答案：(1)免疫排斥反应 抗原决定 表达(2)受精卵 显微注射技术(3)克隆(或“核移植”)(4)药用蛋白 乳腺蛋白 3.(10 分)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子 -肽链第 6 位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常
7、。回答下列问题：(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的_序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作_(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作_。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_，以其作为模板，在_酶的作用下反转录合成 cDNA。cDNA 与载体需在限制酶和_酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_，用相应的抗体进行_杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 【解析】(1)编码血红蛋
8、白的基因中因碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造出新的蛋白质。此操作不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从早期红细胞中提取 mRNA，以 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成 cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和 DNA 连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原抗体杂交实验加以判断。答案：(1)碱基对(或脱氧核苷酸)(2)不属于 没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)4(3)mRNA(或 RNA) 逆转录 DNA 连接(4)蛋白质 抗原抗体
9、4.(11 分)(2019贵阳模拟)乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种 DNA 病毒。科学家利用基因工程的方法将乙肝病毒的表面抗原 H 基因转入某植物叶肉细胞中，从而获得了能产生乙肝疫苗的植株。(1)通过基因工程技术实现的基因交流通常在_(填“种间”或“种内”)进行，这是一种基于_(填“细胞水平”或“分子水平”或“个体水平”)的技术。 (2)质粒能作为基因工程中的基因转移载体，是因为它_(答两点)的特点。 (3)DNA 分子经限制酶切割可以产生黏性末端或平末端，_(填酶的名称)只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能连接平末端。将 H 基因导入叶肉细胞最常用的方法是_，该方法可
10、以使目的基因插入细胞中_的DNA 上。 (4)用该转基因植物叶片饲喂家兔，如果在家兔血清中检测到_，说明转基因植物疫苗可以口服。 【解析】(1)通过基因工程技术实现的基因交流通常在种间进行，是一种基于分子水平的技术。(2)质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA 之外，有自我复制能力，可在细菌细胞间转移，具有多个限制酶的酶切位点，因此质粒能作为基因工程中的基因转移载体。(3)限制酶能识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端。按来源不同，基因工程中所使用的 DNA 连接酶有两类，即 Ecoli DNA 连
11、接酶和 T4DNA 连接酶，其中 Ecoli DNA 连接酶只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间连接起来，不能连接平末端；而 T4DNA 连接酶可以连接黏性末端也可以连接平末端。将目的基因导入不同的受体细胞有不同的方法。导入植物细胞一般采用农杆菌转化法，该方法可以使目的基因插入细胞中染色体的 DNA 上。(4)用该转基因植物叶片饲喂家兔，如果在家兔血清中检测到抗乙肝病毒的抗体，则证明目的基因在受体细胞内已成功表达，说明转基因植物疫苗可以口服。答案：(1)种间 分子水平(2)成分是 DNA，有自我复制能力，可在细菌细胞间转移，具有多个限制酶的酶切位点(3)EcoliDNA 连接酶 农杆菌转
12、化法染色体5(4)抗乙肝病毒的抗体5.(10 分)(2019绵阳模拟)基因工程的应用十分广泛，利用此项技术可创造出更加符合人类需求的优良品种或产品。如美洲拟鲽(是鲽科下的一种比目鱼)的体液中存在抗冻蛋白，能够降低鱼的血液冰点。科学家按 cDNA 路线分离和克隆了抗冻蛋白基因，并将其导入番茄，获得了抗冻的番茄品种。根据有关知识，回答下列问题：(1)基因工程操作的核心步骤为_，以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是_。 (2)将目的基因导入植物细胞最常用的方法是_。 (3)构建重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别
13、序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有 1 个酶的切点。在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？_，理由是_。 (4)质粒作为基因工程常用载体，必须具备的条件是_(至少答 2 点)。 【解析】(1)基因工程操作的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达。其中核心步骤为：基因表达载体的构建；以mRNA 为材料获得 cDNA，是逆转录过程，是以 mRNA 为模板在相关酶的作用下按照碱基互补配对的原则合成 cDNA。(2)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等
14、，其中最常用的是农杆菌转化法。(3)分析可知，限制性内切酶和限制性内切酶切割形成的黏性末端相同，故在 DNA 连接酶的作用下， 这两种限制酶切割后形成的黏性末端能连接。(4)作为基因工程的载体，必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入载体上；必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体 DNA 上随染色体DNA 的复制而同步复制；必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选等。答案：(1)基因表达载体的构建 在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对原则可以合成 cDNA(2)农杆菌转化法(3)能 由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(4)能在宿主细胞内复制并稳定保
15、存；具有多个限制酶的酶切位点有利于剪切66.(10 分)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。如图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的 DNA 和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下列问题：(1)在该过程中，研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因)，并采用_技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件是_、酶、原料、模板，该技术必须用_酶；然后构建基因表达载体，基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外，还需具有_等。 (2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒时，不能使用 Sma切割，原因是_。 图中过程为防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身
16、环化，应选用_对外源DNA、质粒进行切割。 (3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是_。 【解析】(1)由题意可知：抗盐基因属于目的基因，可采用 PCR(聚合酶链式反应)技术扩增目的基因，该技术需要的条件是引物、酶、原料、模板；利用 PCR 技术扩增目的基因时，必须用热稳定 DNA 聚合酶(或 Taq 酶)。基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成。(2)题图显示：质粒上的 M 抗生素抗性基因和目的基因中都含有 Sma的识别和切割位点，若使用 Sma切割，会破坏质粒的抗性基因和外源 DNA 中的
17、目的基因，因此不能使用 Sma切割。抗盐基因(或目的基因)的两侧都有 EcoR的识别和切割位点，因此用 EcoR切割目的基因会出现自身环化；BamH和 Hind识别和切割位点分别位于目的基因的两侧，而且质粒中也有相应的酶切位点，因此用 BamH和 Hind同时进行酶切，才能完整地切下该抗盐基因，同时保证目的基因与质粒的连接方式的唯一性，防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化。(3)检测目的基因是否导入受体细胞，在分子水平上进行检测时，要用放射性同位素标记的抗盐基因(或目的基因)作探针进行分子杂交检测；在个7体水平上进行鉴定时，可将培养的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株
18、的生长状态。答案：(1)PCR(聚合酶链式反应) 引物热稳定性 DNA 聚合(或 Taq) 标记基因(2)Sma会破坏质粒的抗性基因和外源 DNA 中的目的基因 BamH和 Hind(3)抗盐基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态7.(11 分)(2016江苏高考节选)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处
19、于_态的大肠杆菌。 (2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用 PCR 鉴定，所用的引物组成为图 2 中_。 8(3)若 BamH酶切的 DNA 末端与 Bcl酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。 【解题指南】解答本题需要注意两方面：(1)从表格中分析各种限制酶的识别序列和切割位点。(2)构建重组质粒时选择的限制酶不能将质粒上的标记基因全部破坏。【解析】(1)从图 2 中看出，目的基因的两侧含有 4 种限制酶的切点，但是质粒的两个标记基因中都含有 Bam
20、H的切点，因此不能用 BamH切割质粒，只能用 Bcl和 Hind限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过 DNA 连接酶作用后获得重组质粒。如果将重组质粒转入大肠杆菌，需要先用 CaCl2处理大肠杆菌，使其处于能吸收周围环境中 DNA 分子的感受态。(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，凡是能在平板上长出的菌落，就是含有重组质粒的大肠杆菌。如果用 PCR 扩增目的基因，所用的引物为图 2 中引物甲和引物丙，因为这两个引物与模板链结合后能完成目的基因的复制。(3)BamH酶切的 DNA 末端是
21、 ，Bcl酶切的 DNA 末端是 那么连接后连接部位的 6 个碱基对序列为 对于该部位，这两种酶都不能切开，因为连接以后的碱基序列中没有 BamH 和 Bcl 能识别的酶切位点。答案：(1)Bcl和 Hind (DNA)连接 感受(2)四环素 引物甲和引物丙(3) 都不能1.(15 分)(2017全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：9(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的 mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取 RNA 时，提取液中需添加 RNA
22、 酶抑制剂，其目的是_。 (2)以 mRNA 为材料可以获得 cDNA，其原理是_。 (3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。 (4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA 连接酶催化形成的化学键是_。 (5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。 【解析】(1)嫩叶相对于老叶，细胞壁较薄，较易破碎，容易提取几丁质酶的 mRNA；由于RNA 酶可降解 RNA，提取 RNA 时，提取液中应添加 RNA 酶抑制剂，以防止所提取的 RNA 降解。(
23、2)以 mRNA 为模板、4 种脱氧核苷酸为原料，在逆转录酶的作用下，按照碱基互补配对原则，mRNA 可通过逆转录合成 cDNA。(3)目的基因中缺乏复制原点、启动子等，而质粒载体中含有，为了使目的基因在受体细胞中表达，应将目的基因与质粒载体形成重组质粒，导入受体细胞。(4)DNA 连接酶可将同种限制酶切割产生的末端连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(5)几丁质酶基因整合到植物基因组中，但植物抗真菌病的能力没有提高，说明几丁质酶基因在植物细胞中未表达。依据中心法则可知，基因表达包括转录和翻译两个过程，可能是目的基因的转录或翻译过程异常导致目的基因在受体细胞中未表达，进而导
24、致植物抗真菌病的能力没有提高。答案：(1)嫩叶组织细胞易破碎 防止 RNA 降解(2)在逆转录酶的作用下，以 mRNA 为模板按照碱基互补配对的原则可以合成 cDNA(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需的启动子 (4)磷酸二酯键(5)目的基因的转录或翻译异常10【加固训练】启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，其结构如图所示，据图回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶的作用特点是 _。(2)将切割产生的 DNA 片段群体与无启动子的探针载体重组，需要用_。(3)若把重组混合物转化给大肠杆菌，为提高转化效率，常用的方法是_。(4)若插入片段中所含的编码区序列的碱
25、基对数目不能被 3 整除，报告基因能否正常表达？为什么？_。(5)若克隆位点插入了启动子序列，且其中不含编码区序列，但报告基因仍不能正常表达，可能的原因是 _。【解析】本题主要考查基因工程的工具和操作方法。(1)限制性核酸内切酶具有酶的专一性，能识别并切割特定的脱氧核苷酸序列。 (2)将切割产生的 DNA 片段群体与无启动子的探针载体重组，可以用 DNA 连接酶连接二者之间的黏性末端。(3)Ca2+可以增大细胞壁的通透性，提高转化效率。(4)mRNA 中相邻的三个碱基决定一个氨基酸，若插入片段中所含的编码区序列的碱基对数目不能被 3 整除，则与之相连的报告基因不能编码出正确的氨基酸序列，即不能
26、正常表达。(5)启动子插入克隆位点时有两种插入方向，若插入方向错误，则报告基因不能正常表达。答案：(1)识别并切割特定的脱氧核苷酸序列11(2)DNA 连接酶 (3)用 Ca2+处理(4)不能。mRNA 中相邻的三个碱基决定一个氨基酸，若插入片段中所含的编码区序列的碱基对数目不能被 3 整除，则报告基因不能编码出正确的氨基酸序列(5)启动子插入方向不正确2.(15 分)(2019大同模拟)Bt 基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因，因其表达产物 Bt 毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。如图为培育转 Bt 基因苗的基本操作过程。(1)Bt 基因可从构建的 B
27、t 基因组文库中获取，也可以从其 cDNA 文库中获取，从前者获取的基因_(填“含有”或“不含有”)启动子。若利用 PCR 技术扩增 Bt 基因，此过程中 Taq 酶所起的作用是_ _。 (2)步骤中产生的细胞团称为_，步骤和过程要注意控制培养基中_的浓度和用量比例，以便获得幼苗。 (3)我国西北的一些地区年降雨量很小，只适宜种植少数的草本植物，但却被硬性规定种植转 Bt 基因的植物，结果造成减产。这个案例主要违背了生态工程的_原理。 (4)蛋白质工程也被称为_，其基本途径是从_出发，通过设计预期的蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列，进而找到相对应的_，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之
28、后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。 【解析】(1)Bt 基因组文库包括苏云金芽孢杆菌的全部基因，是包含启动子的。若利用 PCR技术扩增 Bt 基因，Taq 酶能够保证在高温条件下从引物起始进行 DNA 子链的合成。(2)步骤在适宜培养基中诱导外植体脱分化形成愈伤组织，图示中的细胞团称为愈伤组织。步骤和过程分别是脱分化和再分化的过程，需要注意控制培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和用量比例，以便获得幼苗。(3)生态工程的原理包括物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理、系统学和工程学原理。我国西北的一些地区不适合种植转 Bt 基因的植物，却被硬性规定种植，结果造成减产的案例主要违背了生态工程的协调与平衡原理。12(4)由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有很多同基因工程技术相似的地方，因此也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期的蛋白质功能出发，通过设计预期的蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列，进而找到相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。答案：(1)含有 保证在高温条件下从引物起始进行 DNA 子链的合成(2)愈伤组织 生长素与细胞分裂素(3)协调与平衡(4)第二代基因工程 预期的蛋白质功能 脱氧核苷酸序列13
