1、ICS 65.120 B 46 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 13682011 饲料中己烯雌酚的测定-气相色谱质谱法 Determination of diethylstilbestrol in feed -Gas chromatography mass spectrometry method 2011 - 03 - 16 发布 2011 - 04 - 16 实施安徽省质量技术监督局 发布DB34/T 13682011 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽
2、省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。 本标准主要起草人：刘红云、吴蕾、蔡一杰、张莉、明文庆、丁作坤、陶小平、钱志平、吴昊。 DB34/T 13682011 1 饲料中己烯雌酚的测定-气相色谱质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中己烯雌酚检验的气相色谱质谱测定方法。 本标准适用于饲料中己烯雌酚的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 试样制备 按
3、GB/T 14699.1 抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取约 200 g，粉碎至过 0.45 mm 孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。 4 原理 饲料中己烯雌酚经缓冲液均质后，用乙腈提取 ，经净化、洗脱、浓缩、用 N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+ 三甲基氯硅烷（TMCS）衍生化后，气相色谱质谱进行定性、定量分析。 5 试剂和溶液 5.1 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水的规定。 5.2 己烯雌酚对照品：纯度99。 5.3 己烯雌酚储备液：准确称取己烯雌酚对照品适量，用甲醇溶解成 1.0 mg/mL 标准储备溶液。4冰箱保存，有效
4、期 6 个月。 5.4 己烯雌酚标准工作液：将储备液用甲醇稀释成 10、50、100、200、500、1000 gL 的标准工作液，在 4 冰箱中存放备用，有效期 7 天。 5.5 正己烷。 5.6 乙酸乙酯。 5.7 碳酸钠。 5.8 正丙醇。 5.9 甲苯：色谱纯。 5.10 甲醇:色谱纯。 5.11 乙腈:色谱纯。 DB34/T 13682011 2 5.12 正己烷/乙酸乙酯：A 溶液为 85:15（V/V）和 B 溶液为 70:30(V/V)。 5.13 10碳酸钠溶液。 5.14 0.02 mol/L 乙酸铵溶液：称取 1.54 g 乙酸铵，加水溶解并稀释至 800 mL 左右，调
5、节 pH 值至5.2，定容至 1000 mL。 5.15 衍生化试剂：N,O- 双（三甲基硅烷基） 三氟乙酰胺（BSTFA） +三甲基氯硅烷 TMCS（99:1） 5.16 硅胶固相萃取柱:规格 1000 mg/6 mL。 5.17 微孔滤膜：孔径 0.25 m，有机相。 6 仪器设备 6.1 气相色谱质谱仪。 6.2 高速冷冻离心机，不低于 4000 r/min。 6.3 饲料粉粹机 6.4 pH 计。 6.5 氮吹仪。 6.6 旋转蒸发仪。 6.7 固相萃取装置。 6.8 分析天平，感量 0.0001 g，0.001 g。 6.9 振荡器。 6.10 涡旋混合器。 6.11 超声波清洗机。
6、 6.12 离心管，50 mL。 6.13 干燥箱。 6.14 梨形瓶，50 mL。 6.15 单通道可调移液器：110 L、550 L、50200 L、200-1000 L。 7 测定步骤 7.1 试样提取 称取粉碎后的饲料样品 5 g 左右（精确至 0.001 g）于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 乙酸铵溶液，均质 1 min，加入 10 mL 乙腈，涡旋振荡提取 30 s，以 4000 r/min 离心 2 min，收集乙腈提取液，残渣再以 10 mL 乙腈，步骤同前，合并两次提取液。 7.2 净化 上述提取液中加入 8 mL 正己烷和 2 mL 乙酸乙酯，涡漩混合 1 min
7、 后以 4000 r/min 离 心 5 min，吸取中间层于 50 mL 梨形瓶中 ，加入 5 mL 正丙醇，在 50水浴中旋转浓缩至干。 用 10 mL 乙酸乙酯溶解残渣，移入离心管中，加入 2 mL 10碳酸钠溶液，漩涡混合 1 min，以4000 r/min 离心 5 min，弃去下层水相，再加入 2 m L 10碳酸钠溶液，重复上述步骤后将乙酸乙酯移入 10 mL 试管中，在 50水浴中用氮气吹干。 用 2 mLA 溶液（5.11）溶解残渣，转移到用 5 mL 正己烷、5 mL 乙酸乙酯活化并抽干处理后的硅胶柱上，用 5 mL 正己烷淋洗，弃去正己烷淋洗液，抽干柱子，用 5 mL B
8、溶液（5.11）洗脱，收集洗脱液，在 50水浴中用氮气吹干。 DB34/T 13682011 3 7.3 样品衍生化 在 7.2 吹干后的样品中加入 100 L 衍生化试剂，振荡混合后，封口，在 60 衍生 15 min，50 水浴中用氮气吹干。冷却后加入 100 L 甲苯，混合后进行气相色谱质谱分析。同时分别取标准工作液（5.3）系列 1 mL 用氮气吹干，加入 10 0 L 衍生化试剂后按试样 同法操作，进行气相色谱质谱分析。 7.4 气相条件 色谱柱： 5苯基甲基聚硅氧烷，柱长 30 m，内径 0.25 mm，膜厚 0.25 m 或性能相当的色谱柱。 进样口温度：220。 升温程序：起始
9、柱温 160（保持 1 min），以 15/m in 的速率升温至 290 保持（5min）。 载气：氦气纯度 99.999。 流量：1.0 mLmin。 进样方式：不分流进样。 进样体积：1.0 L。 7.5 质谱条件 样品离子源：EI源。 离子源温度：200。 传输线温度：280。 四极杆温度：160。 选择离子收集模式，收集质荷比（m/z）为 383，397，412，413 m/z 的 4 个碎片离子。 7.6 上机测定 取标准工作液和样品试液分别注入气质联用仪，记录谱图，按外标法以峰面积进行计算。 8 定性定量方法 定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于 0.5。特征离子基
10、峰丰度与标准品相差不大于 20。 定量方法：以 383，397，412，413 峰面积之和进行校正定量。 9 结果计算 按照下式计算试样中药物的含量： ACsVXAs m =. (1) 式中： X 试样中药物的含量，单位为微克每千克（ g/kg）； A 试样溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值； As 标准溶液的选择性离子色谱图中的峰面积响应值； V 定容体积，单位为毫升（mL）； DB34/T 13682011 4 Cs 标准溶液的浓度，单位为微克每升（ g/L）； m 试样质量，单位为克（g）。 计算结果扣除空白值，平行测定结果用算术平均值表示，结果保留 3 位有效数字。 10 检测方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 灵敏度 本方法的检测限为 1.0 g/kg。 10.2 准确度 本方法添加浓度为 2.0 g/kg，回收 率为 80120。 10.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV10，批间变异系数 CV15。 DB34/T 13682011 5 AA 附 录 A （资料性附录） 己烯雌酚标准品衍生物的选择离子质谱图 图A.1 己烯雌酚标准品衍生物的选择离子质谱图 _
