1、ICS DB51 四川省地方标准 DB51/T 11852011 桑蚕微粒子病诊断技术规程 The technical regulations for diagnosis on pebrine of silkworm (Bombyx mori L.) 2011 - 01 - 25 发布 2011 - 03 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 11852011 I 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 试剂 1 4 仪器、设备 1 5 肉眼诊断 1 DB51/T 11852011 II 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。 本
2、标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局发布。 本标准起草单位：四川省蚕业管理总站、四川省农业科学院生物技术核技术研究所。 本标准主要起草人：吴 钢、蔡平钟、朱洪顺、谢忠良、张学清、马露芸。 DB51/T 11852011 1 桑蚕微粒子病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了四川省桑蚕微粒子病诊断技术要求。 本标准适用于四川省桑蚕微粒子病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 G
3、B/T20395 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 DB51/T844 桑蚕微粒子病防治技术规程 3 试剂 3.1 浓盐酸 w(HCl)=30 。 3.2 氢氧化钾溶液 w(KOH)=2 。 3.3 过氧化氢溶液 w(H2O2)=10 。 3.4 分析用水按 GB/T6682 规定执行。 4 仪器、设备 4.1 普通光学显微镜、相衬（相差）显微镜，放大倍数 1540 倍或 1640 倍；生化培养箱（温控范围10 50 ）、冰箱；天平（感量：0.1 g ）、离心机。 4.2 离心管、无纺布滤纸；载玻片、盖玻片、测微尺；容量瓶、量筒、烧杯、二重皿；乳钵、乳棒；解剖剪、镊子、橡皮吸管；样品袋、冻存管（1.8
4、 mL 、5 mL ）。 5 诊断 5.1 肉眼诊断 5.1.1 外观观察 通过肉眼观察，蚕的不同发育阶段是否具有下列症状： a) 小蚕期：收蚁后不疏毛、体色深暗、体躯瘦小、发育缓慢、重症死亡；群体发育不齐。 DB51/T 11852011 2 b) 大蚕期：表皮缩皱、体呈锈色；体壁出现微细不规则黑褐色病斑，以尾角末端、气门周围和胸腹足外侧部位较多；蜕皮困难，严重死亡；群体发育不齐。 c) 蛹蛾期：蛹表皮无光泽、反应迟钝、腹部松弛，体壁出现微细不规则黑褐色病斑，感病严重的不化蛾、死亡；蛾羽化展翅不良、鳞毛脱落、腹部膨大、节间松弛，交配能力差，产卵少。 d) 卵期：卵形不正，排列不齐、多重叠卵，
5、卵产附差、易脱落，不受精卵和死卵多；催青期发育不整齐。 5.1.2 解剖观察 将外观观察的具有上述大蚕期典型病症的病蚕，用解剖剪从背中线剪开，肉眼观察丝腺是否有乳白色脓疱状斑块。 5.1.3 判定 通过外观观察，蚕的不同发育阶段出现 5.1.1 表述症状之一的，可疑似为蚕微粒子病；通过解剖观察，大蚕期病蚕丝腺出现可见的乳白色脓疱状斑块时，可确诊为蚕微粒子病。 5.2 显微镜诊断 5.2.1 样品采集 采集 5.1.1 描述的典型症状蚕、蛹、蛾、卵。采集的样品置于样品袋或冻存管中，做好记载。 5.2.2 样品处置 5.2.2.1 样品保存 采集的样品每份混合均匀后再分成 2 份，其中 1 份作为
6、检样按照 5.2.2.2 制备检验，另 1 份作为备样，保存于 0 4 冰箱中，保存期 30 d 60 d。 5.2.2.2 样本制备 5.2.2.2.1 不同发育时期的样品，按照下列方法制样： a) 蚁蚕样品置生化培养箱于温度 29 0.5 、相对湿度85 % 条件下，放置 2 d3 d。 b) 小蚕期、大蚕期、蛹期、蛾期样品置生化培养箱于温度 29 32 、相对湿度85条件下，放置 2 d5 d ；大蚕期、蛹期经高温处置的样品，可用解剖剪沿背中线剪开，摘取其中肠，每1 头 5 头蚕或 1 粒 2 粒蛹的中肠为 1 个样。 c) 卵期样品解除滞育后，在生化培养箱温度 29 0.5 、相对湿度
7、85 的条件下催青；孵化后待其自然死亡。 5.2.2.2.2 将上述制备的样本每份分别置于 1 个乳钵孔中，每孔各放 1 个乳棒，磨碎；滴入 4 滴10滴氢氧化钾溶液 w(KOH)= 2 ，再次研细。 5.2.2.2.3 按照乳钵序号，将磨碎液用乳棒点样至载玻片，盖上盖玻片，制成镜检样本。 5.2.3 显微镜检查 5.2.3.1 直接观察法 将镜检样本，置于显微镜（1540 倍或 1640 倍）下观察，每个样本观察不少于 20 个视野，观察有无微粒子孢子。 DB51/T 11852011 3 5.2.3.2 离心沉淀法 将 5.2.2.2.2 制备的磨碎液，用无纺布滤纸过滤后，将滤液移入离心管
8、中，经 3000 r/min 离心 3 min，倾去上清夜，沉淀物振荡制镜检样本，置于显微镜（1540 倍或 1640 倍）下观察，每个样本观察不少于 20 个视野，观察有无微粒子孢子。 5.2.3.3 酸溶解法 将检出有微粒子孢子的磨碎液吸取 2 滴，分别滴于载玻片两端，自然干燥后在其中 1 点加 1 滴浓盐酸 w(HCl)=30 ，另 1 点作对照，在 30生化培养箱中放置 10 min20 min 后，盖上盖玻片镜检（1540倍或 1640 倍）。如果样本已干，可加无菌水 1 滴。经过酸处理的样本，微粒子孢子溶解消失，真菌孢子保持原状。 5.2.3.4 过氧化氢法 将 5.2.3.1、
9、5.2.3.2 镜检出有微粒子孢子原液吸取 1 滴，滴于载玻片上，再将过氧化氢溶液 w(H2O2)=101 滴2 滴滴于孢子液中，盖上盖玻片，经过 10 min30 min ，相衬（相差）显微镜镜检（1540 倍或 1640 倍），活微粒子孢子释放出极丝。 5.2.4 判定 当镜检发现孢子呈长卵圆形，大小为3.6 m3.8 m2.0 m2.3 m，呈淡绿色，折光性强，中间隐约可见1 根黑色线状物，表面光滑，孢子活泼，多左右摆动，有时可见翻滚现象时，孢子则为蚕微粒子孢子（参见GB/T20395 附录A 微粒子孢子图），原样品确诊为蚕微粒子病。 加浓盐酸作用后，被溶解的孢子为微粒子孢子，原样品确诊为蚕微粒子病。 加过氧化氢作用后，活微粒子孢子释放出极丝，原样品确诊为蚕微粒子病。 _
