1、 ISO 2013 Qualit de leau Dnombrement de Clostridium perfringens Mthode par filtration sur membrane Water quality Enumeration of Clostridium perfringens Method using membrane filtration NORME INTERNATIONALE ISO 14189 Premire dition 2013-11-01 Numro de rfrence ISO 14189:2013(F) ISO 14189:2013(F)ii ISO
2、 2013 Tous droits rservs DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2013, Publi en Suisse Droits de reproduction rservs. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la phot
3、ocopie, laffichage sur linternet ou sur un Intranet, sans autorisation crite pralable. Les demandes dautorisation peuvent tre adresses lISO ladresse ci-aprs ou au comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Ch. de Blandonnet 8 CP 401 CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland Tel.
4、 +41 22 749 01 11 Fax +41 22 749 09 47 copyrightiso.org www.iso.org ISO 14189:2013(F)Avant-propos iv Introduction v 1 Domaine dapplication . 1 2 Rfrences normatives . 1 3 Termes et dfinitions . 1 4 Principe 2 5 Appareillage et verrerie 2 6 Milieux de culture et ractifs . 3 6.1 Matriaux de base 3 6.2
5、 Milieux de culture . 3 6.2.1 Glose Tryptose-Sulfite-Cyclosrine (glose TSC), Rfrences 61112 . 3 6.2.2 Glose au sang ou base de glose Columbia ou autre glose adapte riche en nutriments . 3 6.2.3 Ractif de la phosphatase acide 3 7 chantillonnage . 3 8 Mode opratoire 3 8.1 Transport et stockage de lcha
6、ntillon . 3 8.2 Prtraitement thermique pour la slection des spores . 3 8.3 Dilution de lchantillon 4 8.4 Filtration . 4 8.5 Incubation et examen 4 8.6 Confirmation de Clostridium perfringens 4 8.6.1 Gnralits 4 8.6.2 Essai la phosphatase acide 5 8.6.3 Interprtation . 5 9 Expression des rsultats. 5 10
7、 Rapport dessai . 5 11 Assurance de la qualit 5 Annexe A (normative) Composition et prparation des milieux de culture et des ractifs 7 Annexe B (informative) Donnes de performance . 9 Bibliographie .12 ISO 2013 Tous droits rservs iii Sommaire Page ISO 14189:2013(F) Avant-propos LISO (Organisation in
8、ternationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique c
9、r cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les procdures utilis
10、es pour laborer le prsent document et celles destines sa mise jour sont dcrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des diffrents critres dapprobation requis pour les diffrents types de documents ISO. Le prsent document a t rdig conformment aux rgles de
11、 rdaction donnes dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www. iso.org/directives). Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas av
12、oir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. Les dtails concernant les rfrences aux droits de proprit intellectuelle ou autres droits analogues identifis lors de llaboration du document sont indiqus dans lIntroduction et/ou dans la liste des dclarations de brevets reues par lI
13、SO (voir www.iso.org/brevets). Les appellations commerciales ventuellement mentionnes dans le prsent document sont donnes pour information, par souci de commodit, lintention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement. Pour une explication de la signification des termes et expressions
14、spcifiques de lISO lis lvaluation de la conformit, ou pour toute information au sujet de ladhsion de lISO aux principes de lOrganisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html Le prsent document a t
15、 labor par le comit technique ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 4, Mthodes microbiologiques.iv ISO 2013 Tous droits rservs ISO 14189:2013(F) Introduction Les bactries Clostridium perfringens sont largement reconnues comme tant un prcieux indicateur de pollution fcale. Dans le tractus intesti
16、nal des animaux et de lhomme, ces bactries Gram positives forment des spores qui, contrairement aux cellules vgtatives, sont rsistantes la chaleur. Dans les intestins, C. perfringens est prsent sous forme de spores et de cellules vgtatives, lesquelles se retrouvent galement dans les chantillons envi
17、ronnementaux. Les spores de C. perfringens survivent dans leau pendant des mois, ce qui est nettement plus long que les bactries vgtatives indicatrices dune contamination fcale et, par consquent, la prsence de ces spores peut indiquer une pollution fcale loigne ou intermittente. La surveillance de C
18、 perfringens sest avre utile pour valuer la qualit des ressources en eau et contrler les phases du traitement de leau afin den valuer les performances. Les spores ne sont pas toujours inactives par les modes opratoires de dsinfection de routine (chloration, par exemple). ISO 2013 Tous droits rservs
19、 v Qualit de leau Dnombrement de Clostridium perfringens Mthode par filtration sur membrane AVERTISSEMENT Il convient que les utilisateurs du prsent document matrisent les pratiques courantes de laboratoire. Le prsent document ne prtend pas couvrir tous les problmes de scurit potentiels associs son
20、utilisation. Il est de la responsabilit de lutilisateur dtablir les pratiques de scurit et de sant appropries et dassurer la conformit aux rglementations nationales. IMPORTANT Il est absolument indispensable que les essais mens conformment au prsent document le soient par du personnel dment qualifi.
21、 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode pour le dnombrement des cellules vgtatives et des spores de Clostridium perfringens par filtration sur membrane dans des chantillons deau destine la consommation humaine. Cette mthode peut toutefois sappliquer tous les types
22、dchantillons deau, sous rserve quils ne contiennent pas de matire particulaire ou collodale interfrant avec la filtration. 2 Rfrences normatives Les documents ci-aprs, dans leur intgralit ou non, sont des rfrences normatives indispensables lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, se
23、ule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 8199, Qualit de leau Lignes directrices gnrales pour le dnombrement des micro-organismes sur milieu de culture ISO/TS 11133-1, Microbiologie des alime
24、nts Lignes directrices pour la prparation et la production des milieux de culture Partie 1: Lignes directrices gnrales dassurance qualit pour la prparation des milieux de culture en laboratoire ISO 19458, Qualit de leau chantillonnage pour analyse microbiologique Guide ISO/IEC 2:2004, Normalisation
25、et activits connexes Vocabulaire gnral 3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions donns dans le Guide Guide ISO/IEC 2 ainsi que les suivants sappliquent. 3.1 Clostridium perfringens prsomptives bactries qui produisent toutes les nuances de colonies noires ou
26、 grises jaunes-brunes sur la glose Tryptose-Sulfite-Cyclosrine, mme si la coloration est lgre, aprs incubation anarobie (44 1) C pendant (21 3) h Note 1 larticle: lArticle Contrairement aux colonies qui se dveloppent directement sur le milieu glos, les colonies sur la membrane ne prsentent pas toujo
27、urs un noircissement distinct et, de ce fait, les colonies lgrement colores sont incluses dans le dnombrement. NORME INTERNATIONALE ISO 14189:2013(F) ISO 2013 Tous droits rservs 1 ISO 14189:2013(F) 3.2 Clostridium perfringens confirmes bactries qui produisent des colonies caractristiques sur la glos
28、e Tryptose-Sulfite-Cyclosrine et possdent lenzyme phosphatase acide 4 Principe Un volume mesur de lchantillon, ou une dilution de ce dernier, est filtr travers une membrane ayant des pores de 0,45 m, cette dimension tant suffisante pour retenir les spores de clostridia. La membrane est incube sur un
29、e glose slective/diffrentielle (glose Tryptose-Sulfite-Cyclosrine) en anarobiose (44 1) C pendant (21 3) h. Les C. perfringens produisent gnralement des colonies de couleur noire ou grise jaune-brune suite la rduction du sulfite en sulfure qui ragit avec un sel ferrique prsent dans le milieu. Les co
30、lonies caractristiques sont dnombres et des essais de confirmation raliss. Le rsultat calcul est exprim en units formant colonie par volume dchantillon. Si seul un dnombrement de spores est requis, lchantillon est dabord soumis un prtraitement (60 2) C afin dinactiver les bactries vgtatives. NOTE 1
31、Le milieu contient de la cyclosrine comme agent slectif pour inhiber les espces de Bacillus. NOTE 2 Lincubation 44 C augmente la slectivit de lessai pour C. perfringens. 5 Appareillage et verrerie Hormis la verrerie ou le matriel en plastique usage unique qui est fourni strile, striliser la verrerie
32、 tel que spcifi dans lISO 8199. Utiliser un quipement de microbiologie courant et, en particulier: 5.1 Appareillage de filtration sur membrane, tel que spcifi dans lISO 8199. 5.2 Entonnoirs de filtration striles Utiliser des entonnoirs striles usage unique ou striliss conformment lISO 8199. Alternat
33、ivement, flamber les entonnoirs mtalliques avant de les utiliser. NOTE Pour cette mthode, une dsinfection des entonnoirs par bullition nest pas suffisante. 5.3 Membranes filtrantes striles, ayant des pores de dimension nominale 0,45 m. La qualit des membranes filtrantes peut varier dun fournisseur l
34、autre, voire dun lot un autre. Il est donc conseill de vrifier rgulirement la qualit des membranes. 5.4 tuves thermostates, pouvant tre maintenues (36 2) C et (44 1) C. 5.5 Bain deau (facultatif), pouvant tre maintenu (60 2) C et quip dun systme de circulation deau. 5.6 Autoclave, pouvant tre mainte
35、nu (121 3) C. 5.7 Pince strile 5.8 Jarres anarobies, ou quipement similaire. 5.9 Systme gnrateur de gaz anarobie, pour produire une atmosphre contenant approximativement 90 % dhydrogne et 10 % de dioxyde de carbone.2 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 14189:2013(F) 6 Milieux de culture et ractifs 6.1 M
36、atriaux de base Pour luniformit des rsultats, les constituants utiliss dans la prparation des milieux doivent tre de qualit uniforme et les produits chimiques de qualit analytique reconnue. Pour la prparation des milieux, utiliser de leau distille dans une verrerie ou de leau dionise de puret quival
37、ente, tel que spcifi dans lISO 3696 1pour une eau de qualit 3. Il est galement possible dutiliser un milieu complet dshydrat et des ractifs disponibles dans le commerce, prpars et utiliss conformment aux instructions du fabricant. Dautres qualits de produits chimiques peuvent tre utilises, sous rser
38、ve de dmontrer quelles conduisent aux mmes rsultats. 6.2 Milieux de culture Voir Annexe A. 6.2.1 Glose Tryptose-Sulfite-Cyclosrine (glose TSC), Rfrences 61112 Voir A.1. 6.2.2 Glose au sang ou base de glose Columbia ou autre glose adapte riche en nutriments Voir A.2. 6.2.3 Ractif de la phosphatase ac
39、ide Voir A.3. 7 chantillonnage Procder lchantillonnage tel que spcifi dans lISO 19458. 8 Mode opratoire 8.1 Transport et stockage de lchantillon Dbuter lexamen ds que possible aprs le prlvement de lchantillon, de prfrence le mme jour. Il convient de refroidir les chantillons pendant le transport, id
40、alement (5 3) C. La dure de stockage maximale recommande pour lchantillon, transport inclus, est de 12 h pour les bactries vgtatives et de 24 h pour les spores. La dure de stockage de lchantillon, transport inclus, ne doit pas dpasser 18 h pour les bactries vgtatives et 72 h pour les spores. 8.2 Prt
41、raitement thermique pour la slection des spores Si seul un dnombrement de spores est souhait, bien homogniser lchantillon puis le chauffer (60 2) C dans un bain deau pendant (15 1) min. Il convient que le volume chauff soit suprieur celui analyser. Il est recommand de surveiller la temprature en pla
42、ant un thermomtre adapt dans un flacon de rfrence de taille identique au flacon dchantillon et contenant le mme volume deau la mme temprature initiale que lchantillon en cours de traitement. Le temps requis pour atteindre (60 2) C ne doit pas dpasser 15 min et peut tre rduit en assurant une circulat
43、ion deau dans le bain afin doptimiser lchange thermique. ISO 2013 Tous droits rservs 3 ISO 14189:2013(F) 8.3 Dilution de lchantillon Il convient de choisir un volume dessai de lchantillon ou une dilution de ce dernier - aprs le traitement thermique si requis - de manire obtenir, si possible, entre 1
44、0 et 80 colonies sur une membrane de 47 mm 50 mm de diamtre. Il est recommand de prparer les volumes dessai ou les dilutions conformment la description de lISO 8199. 8.4 Filtration Pour obtenir une description gnrale de la mthode de filtration sur membrane, voir lISO 8199. Filtrer un volume deau mes
45、ur. Il convient dadapter le volume au type deau en cours danalyse. Pour les eaux destines la consommation humaine, un volume de 100 ml est gnralement filtr. Enregistrer le volume filtr. Aprs la filtration, placer la membrane face quadrille vers le haut sur une boite de glose TSC, en vrifiant quaucun
46、e bulle dair nest pige sous le filtre. NOTE Il est galement possible de recouvrir le filtre dune mince couche (5 ml 10 ml environ verss dans une bote de Petri de 90 mm de diamtre) de glose TSC fondue (maintenue dans un bain deau (45 1) C). Laisser solidifier avant lincubation anarobie. Ce mode oprat
47、oire peut amliorer le noircissement des colonies. Il nest pas ncessaire dajouter de la cyclosrine dans la glose TSC pour le recouvrement. Cependant, lobtention de cultures pures pour lessai de confirmation peut savrer plus laborieuse. Comme les spores de C. perfringens sont plus rsistantes la chaleur, des entonnoirs striles doivent tre utiliss (5.2). Lutilisation dun bain deau en
