1、ICS 07.100 B 46 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 30622018 微生物饲料添加剂质量控制技术规范 Technical specification on quality control of microbial feed additives 2018 - 10 - 30 发布 2018 - 11 - 30 实施 辽宁省 市场监督管理 局 发布 DB21/T 30622018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2015给出的规则 起草。 本标准由 辽宁省 畜牧 兽医 局 提出 并归口 。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料
2、畜产品质量安全检测中心 。 本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、高铎、武凤娇 、田晓玲 。 DB21/T 30622018 1 微生 物 饲料添加剂质量控制技术 规范 1 范围 本标准规定了 微生物 饲料添加剂 及混合型微生物饲料添加剂 生产、 采样、 检 验、鉴 定、 包装、 保存 、 运输过程中的 质量控制 和技术要求 ，描述了菌种检验、鉴定及产品性能验证的通用方法。 本标准适用于 微生 物 饲料添加剂 及混合型微生物饲料添加剂 ，不适用于转基因微生物饲料添加剂 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少 的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期
3、的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 10648 饲料标签 GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 23181 微生物饲料添加剂通用要求 NY/T 1444 微生物饲料添加剂技术通则 JJF 1070 定量包装商品净含量计量检验规则 中华人民共和国兽药典 中华人民共和国农业部公告第 2045 号饲料添加剂品种目录 伯杰氏细菌系统鉴定手册 伯杰氏细菌命名手册 3 术语和定 义 3.1 微生物饲料添加剂 Microbial feed additives 微生物饲料添加剂是指在饲料中添加或直接饲喂给动物的微生物或微生物及其培养物，参与调节胃 肠道内微生态平衡或者刺激特异性
4、或非特异性免疫功能、具有促进动物生长和提高饲料转化效率的微生 物制剂。 3.2 混合型 微生物 饲料添加剂 Mixed microbial feed additives 由一种或一种以上的 微生物饲料 添加剂与载体或稀释剂按一定比例混合，但不属于添加剂预混合饲 料的饲料添加剂产品 。 3.3 目的菌 Target microorganisms 系指直接 用于生产的菌种。 3.4 种子批 Seed lot 系指特定菌株的贮存物，通常包括原始种子、主种子批和工作种子批，建立种子批系统旨在保证原 粉生产的一致性。 DB21/T 30622018 2 3.5 原始种子 Primary seed 系指细
5、菌分离株经适应性培养、传代后，经生物学特性、免疫原性和遗传稳定性等特性研究鉴定， 可用于微生物饲料添加剂生产的种子。原始种子用于主种子批的制备。 3.6 主种子 Main seed 系由原始种子传代扩增至特定代次，并经一次制备获得的同质和均一的悬液或干粉分装于容器制备 而成。主种子用于制备工作种子。 3.7 工作种子 Working seed 系由主种子传代扩增至特定代次，并经一次制备获得的同质和均一的悬液分装于容器制备而成。 4 生产要求 微生 物 活菌的制备方法、 工艺应能保证 其 成品含有足够的活菌数量， 并在有效期内 保持其稳定性， 同时应防止外源因子的污染。 4.1 生产用菌种 4.
6、1.1 名称及来源 生产用菌种 应来自 动物 体内 和人体 的 正常菌群 ; 或 对 动物 体 及 人体无毒无害、具有促进正常菌群生 长和活性作用的外籍细菌 。 细菌的分离过程和传代背景应清晰，应具备稳定的生物学和遗传学特性，并 能保持稳定的活菌状态，经实 验室和临床试验证明安全、有效。 并 获得具 有资质 的微生物鉴定机构出具 的菌种 鉴定报告。 4.1.2 种子批的建立 种子批分 为 三级，分别为原始种子、主种子和工作种子。 4.1.3 种子批的检定 菌种的属、种型分类鉴定，应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册（ Bergey s Manual of Systematic Bacteriol
7、ogy）和伯杰氏细菌命名手册（ Bergey s Manual of Determinative Bacteriology）的有关规定进 行，包括形态、生长代谢特性检查。 4.1.3.1 培养特性 将菌 种接种 于 特异性 培养基，置有氧或厌氧环境中培养，观察其生长情况， 确定菌种的好氧条件 ； 以划线法观察在琼脂 平皿上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征；也可观 察菌种在不同温度、 pH 值或不同浓度的氯化钠溶液等条件下的生长特性等 。 4.1.3.2 染色镜检 取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等， 有芽孢的细菌应同时
8、观察芽孢的形状、大小和位置（也可增做芽孢染色）。检查结果均应符合原始菌种 的特性。 4.1.3.3 生化反应 按 特异 的方法进行， 应包括目的 菌的关键生化反应， 结果应符合原始菌种的特性。 4.1.3.4 遗传特性分析 采用 16S rRNA 序列测定，应符合原始菌种的遗传特性。 DB21/T 30622018 3 4.1.3.5 种子批 的保存 原 始种子和主种子应冻干保存 于 4 或 -20 ，工作种子应置于 2 8 保存。 种子批传代应限定传代次数，原始种子批和主种子批启开后传代次数不得超过 10 代，工作种子批 启开后至发酵培养传代次数不得超过 5 代。 4.1.3.6 安全性评价
9、实验 4.1.3.6.1 毒性试验 可选用 靶标 动物进行试验或采用常规方法进行。 常规方法 : 用体重 18 22g 小鼠 5 只，每只腹腔 注射 0.3mL 新鲜菌液，连续观察 3 天，小鼠均应健 康存活；或每只小鼠经口灌胃 0.5mL 新鲜菌液，每天 1 次，连续 3 天，从第 1 天 至第 7 天 连续观察， 小鼠均应健康存活 。 注：新鲜菌液 浓度 为不少于推荐常规菌 种使用时浓度。 4.1.3.6.2 抗生素敏感性试验 采用 琼脂扩散纸片法 或 微量稀释法 进行菌株的抗生素敏感性检查，应符合 原始 菌种的特性。 4.1.3.6.3 稳定性试验 . 菌种在 特异性 培养基中，连续 传
10、代 30 代次后，将第 30 代培养物做种子批 检查、鉴定 ，全部结果应 与原始菌种的特性一致。 4.1.3.6.4 选择性特性试验 应根据原始菌种的特性进行耐热性、耐酸性、耐碱性、耐胆盐等相关特性考察。 4.1.4 菌种保藏与管理 4.1.4.1 管理制度 建立菌种管理制度，对菌种实行全流程管理。对菌种的保管应有专人负责，单独保藏，实行双人双 锁管理。应有程序和措施以保证菌种的安全，防止污染、丢失或损坏。 4.1.4.2 菌种档案 应建立菌种档案，涵盖来源、鉴定、特性、保存、传代、使用等信息，确保溯源性和稳定性。菌种 信息应完整、准确、清晰的标识于菌种保藏管。 4.2 菌 粉 制备 应包括种
11、子液制备、大罐培养、收获菌体（或芽孢）和菌体干燥制成 菌 粉 等 。 4.2.1 生产用种子 使用主 种子批菌种，接种 于 特异性 培养基进行多级种子扩增，应涂片做革兰氏染色，在显微镜下观 察 5 10 个视野，细菌的染色反应、形态应一致并符合原始菌种的特征。制备过程应防止污染，菌种传 代次数应符合规定。 4.2.2 生产车间 或实验间 生产车间 或实验间 符合相应实验室无菌级别要求。生产设备和管路 应经 过严格灭菌 ，灭菌 后检测合 格方可使用，避免交叉污染。 4.2.3 培养基 采用经批准的培养基用于生产 ， 培养基应经过 高压蒸汽 灭菌 。 4.2.4 培养 DB21/T 3062201
12、8 4 采用液体培养。将种子液置 于 特异性 条件下培养（包括厌氧或需氧、温度、时间等），培养过程中 取样涂片做革兰氏染色镜检、 pH 值检测等，芽孢菌 需要 进行芽孢形成率的检测，均应符合 该菌种的 规 定。培养结束后 ， 取样做纯菌检查，如发现污染应予废弃。 4.2.5 收获菌体 液体菌 培养结束后 直接分装 收获。 菌 粉 培养结束后 采用 分离 技术 收获湿菌体，与分散剂、稳定剂混合 后制成干粉。 4.3 微生物饲料添加剂 同一工作种子批菌种生产的最多 2批单 一 菌粉 ， 可按批准的比例与辅料混合均匀后制成 微生物饲料 添加剂 ，配制过程应防止污染。 微生物饲料添加剂浓度为每 千克
13、全价料中不低于 106cfu。 4.4 混合型 微生物 饲料添加剂 混合型微生物饲料添加剂包括固态型、液态型和半固态型。 4.4.1 菌体组成要求 生产混合型微生物饲料添加剂时，应每种菌分别培养制备单一菌粉。 混合型微生物饲料添加剂应选 择附录 A.1中所列菌种，且菌种数目不宜超过 5种 。 使用一种以上菌时，不同菌之间应通过协同关系试验。 4.4.2 分批 同一批号， 原料 应来源一致、质量均一，按规定要求抽样检验后， 能对整批 产 品作出评定。 5 采样要求 5.1 采样原则 采集的样品要具有代表性，能反映被采样本的总体水平 ，且避免引入外来污染 。 5.2 采样人员 采样应由受过相应培训
14、的人员进行 ，采样人员应具备对微生物生物危害及防止交叉污染的常识 ， 采 样时应采取佩戴口罩、手套等措施保证自身安全及避免外来污染。 5.3 采样工具 采样工具 和取样容器 要达到无菌的要求。 5.4 采样数量 采样数量可 结合检验需要量，应考虑到 样品 分布的均一性 。 5.5 采样过程 采样应与样品 存在 环境一致，对于有完整包装的样品，尽可能整件抽取，减少操作过程，避免污染。 对于无完整包装或需要打开包装抽 取的样品，要求无菌取样。应对样品信息进行及时、准确的记录和标 记。 DB21/T 30622018 5 6 检定要求 6.1 微生物饲料添加剂检定 6.1.1 感官要求 应 包括颜色
15、、气味和有无霉变 。 6.1.2 目的菌检查 取菌粉加人灭菌生理 盐水 或其他 专属 稀释液 稀释至 1103cfu/mL， 接种 在 特异性 琼脂平皿上， 每个 菌种的 培养特性 、染色镜检和生化反应检查，应符合 该 菌种特征 。 6.1.3 活菌数测定 测定每克 或每毫升 菌粉中含有的活菌数量。 活菌数测定方法 按照 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物检 验、饲料添加剂 饲用活性干酵母（酿酒酵母）、 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 等 方法执行 ，详见 附录 A.2。 6.1.4 杂菌检查 方法和结果判断 按 NY/T 1444执行 ， 如不符合 规定应废弃。 6.1.5 卫生指标测定 常规指标
16、 方法 按 表 1执行 。 表 1 微生物添加剂卫生指标要求 项目 指标 试验方法 黄曲霉素 B1， g/kg 10.0 GB/T 17480 砷（以总砷计）的允许量， mg/kg 2.0 GB/T 13079 铅（以 Pb 计）的允许量， mg/kg 5.0 GB/T 13080 汞（以 Hg 计）的允许量， mg/kg 0.1 GB/T 13081 镉（以 Cd 计）的允许量， mg/kg 0.5 GB/T 13082 大肠菌群的允许量，个 /kg 1.010 5 GB 4789.3 霉菌总数的允许量，个 /kg 2.010 7 GB/T 13092 沙门氏菌的允许量 不得检出 GB/T
17、13091 致病菌（肠道致病菌及致病性球菌） 不得检出 GB 4789.3、 GB 4789.5 和 GB 4789.10 6.2 混合型 微生物 饲料添加剂 检定 6.2.1 感官要求 应 包括颜色、气味和有无霉变 。 6.2.2 目的菌检查 检査成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述 “4.1.3”方法进行生长特性、染色镜 检和生化反应检查，应符合规定。 对于 混合型饲料添加剂 ，则须逐一检查单 一 菌特性。 DB21/T 30622018 6 6.2.3 活菌数 测定 测定每克 或每毫升产 品中的活菌数， 混合型饲料添加剂 应分别测定各单 一 活菌数。 测定方法 按上述 “
18、6.1.3”执行 。 6.2.4 杂菌检查 方法和结果判 断 按 NY/T 1444执行 。 6.2.5 卫生 指标测定 常规指标 方法 按 6.1.5执行 。 6.2.6 净含量 按 JJF 1070执行 。 7 标签、规格和包装 7.1 标签 标签按 GB 10648执行，同时标识活菌数的下限、杂菌数的上限。 7.2 包装 应符合 GB/T 23181的有关规定 ，包装材料应无毒无菌， 内包装物采用符合卫生标准的材 料 ，对产品 无抑制性 。 8 运输 和 贮 存 8.1 运输 产品在 运输 过程中应避免暴晒、雨淋和受热 ， 不得与有毒有害物品混装混运。 8.2 贮存 产品应贮存于阴凉、通
19、风、干燥处，防止暴晒、雨淋和受热 ， 如有特殊要求应 注明 。 9 保质期 自生产之日起，按批准的有效期执行。 DB21/T 30622018 7 A A 附 录 A （规范性附录） 饲料添加剂微生物品种目录 表 A.1 饲料添加剂微生物品种目录 类别 通用名称 适用范围 微生物 地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳 酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种（原名：乳酸 乳杆菌）、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒 酵 母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春 双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑
20、曲霉、米曲霉、 迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆 菌保加利亚亚种（原名：保加利亚乳杆菌） 养殖动物 产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌 青贮饲料、牛饲料 副干酪乳杆菌 青贮饲料 凝结芽孢杆菌 肉鸡、生长育肥猪 、 水产养殖动物 、犬和猫 侧孢短芽孢杆菌 (原名：侧孢芽孢杆菌 ) 肉鸡、肉鸭、猪、虾 丁酸梭菌 断奶仔猪、肉仔鸡 表 A.2 生产及质量控制中参考标准 标准序号 标准名称 检测方法 GB/T 20191 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物检验 GB/T 22547 饲料添加剂 饲用活性干酵母（酿酒酵母） GB/T 26428 饲料微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 NY/T
21、 1461 饲料微生物添加剂 地衣芽孢杆菌 NY/T 1969 饲料添加剂 产朊假丝酵母 NY/T 2131 饲料添加剂 枯草芽孢杆菌 SN/T 3542 光合细菌菌剂中沼泽红假单胞菌计数方法 SN/T 4624.2 入境环保用微生物菌剂检测方法第 2 部分：短小芽孢杆菌 卫生指标 GB 4789.34 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验 GB 8381.2 饲料中志贺氏菌的检测方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T 13092 饲料中霉菌总数测定方法 GB/T 13093 饲料中细菌总数的测定 GB 4789.3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 其他 GB 19489 实验室生物安全通用要求 DB21/T 30622018 8 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 50073 洁净厂房设计规范 SN/T 1538.1 培养基制备指南 SN/T 2632 微生物菌种常规保藏技术规程 SN/T 3229 食品消毒剂和防腐剂杀菌效果评价方法 _
