1、ICS 65.020.20 B 20 DB41 河南省 地 方 标 准 DB 41/T 1733 2018 玉米 中 伏马毒素 B1测定 荧光偏振免疫分 析法 2018 - 11 - 26发布 2019 - 02 - 26实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 1733 2018 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 试剂 . 1 5 仪器 设备 . 2 6 试样制备 . 2 7 分析步骤 . 2 7.1 提取 . 2 7.2 测定 . 2 8 计算 . 3 9 精密度 . 3 9.1 重复性 . 3 9.2 再现性 . 3
2、DB41/T 1733 2018 II 前 言 本标准按 照 GB/T 1.1 2009给 出的规则起草。 本标准由河南省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 、 河南省农产品质量安全检测 中心 、 延津县 农产品质量安全检测站 。 本标准主要起草人： 刘冬梅、刘继红、王 红旗、余新华、李淑芳、尹海燕、马莹、张军锋 、 张迪、 曹成、徐晋豫。 DB41/T 1733 2018 1 玉米 中 伏马毒素 B1的 测定 荧光偏振免疫分析法 1 范围 本标准规定了玉米伏马毒素 B1的测定 荧光偏振免疫分析法。 本标准适用于玉米中伏马毒素 B1的测定。 本 标
3、准的检测 限为 0.47 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 。 3 原理 试样中 用磷酸 盐缓冲溶液提取的 伏马毒素 B1与伏马毒素抗体形成复合物。在溶液中加入伏马毒素 B1 荧光标记物，与伏马毒素 B1竞争伏马毒素抗体，形成伏马毒素 B1荧光标记物与伏马毒素抗体的复合物产 生荧光偏振。通过测定荧光偏振强度计算伏马毒素 B1含量。 4 试剂 试剂中的用水应 符合 GB/T 6682 分析
4、实验室用水规格和试验方法 。 4.1 伏马毒素 B1荧光标记物 （ 6， -（ 4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素标记的伏马毒素 B1， 6-DTAF） （ 伏 马毒素 B1荧光标记物 的配置详见附录 A） 4.2 伏马毒素抗体 （ P2A5-3-F3） 。 4.3 -牛血清球蛋白（ -BGG）， 99%， CAS 号 9007-83-4。 4.4 甲醇 (色谱纯 )。 4.5 乙腈 (色谱纯 )。 4.6 伏马毒素 B1标准品： 纯度 95%；或经过国家认证授予标准物质证书的标准物质。 4.7 10 mM 磷酸盐缓冲溶液（ PBS 缓冲溶液）：其中含有 10 mM 磷酸钠， 0.15M 氯化钠，
5、 pH=7.2。 4.8 0.1% -BGG 溶液：称取 0.05 g -BGG（ 4. 3）溶解于 50mL 10mM PBS 缓冲 溶 液中 （ 4. 7） 。 4.9 伏马毒素 B1荧光标记物储备液（ 100 g / mL）：取 1 mg 伏马毒素 B1荧光标记物 （ 4. 1） ，用甲 醇 （ 4. 4） 溶解，定容到 10 mL，储存与棕色瓶中， 4 保存。 4.10 伏马毒素荧光标记物使用液（ 0.4g / mL）：取 8L 伏马毒素 B1荧光标记物储备液（ 4. 9） ，加 入到 1992L 10mM PBS 缓冲 溶 液 （ 4. 7） ，储存 于 棕色瓶中。现配现用。 4.1
6、1 抗体溶液 （ 4.0 g / mL） ：抗体用 0.1% -BGG 溶液（ 4.8）稀释 到浓度为 4.0g / mL。 4.12 1000mg / L 伏马毒素 B1标准贮备液：称取 10mg 伏马毒素 B1标准品 （ 4.6） ，用甲醇溶解，定容 到 10mL 容量瓶中。 -20 冰箱中保存。 DB41/T 1733 2018 2 4.13 50mg / L 伏马毒素 B1标准使用液：取 75 L 标准贮备液 （ 4. 12） ，加入到 1425 L 10 mM PBS 缓冲溶液中 (4.7)，混匀。溶液浓度为 50 mg/L。现配现用。 4.14 伏马毒素 B1标准 工作 液： 分别
7、准确吸取 伏马毒素 B1标准 使用 液 （ 4.13） 0.002 mL、 0.004 mL、 0.02 mL、 0.04 mL、 0.10 mL、 0.20 mL、 0.40 mL、 1.00 mL、 4.00 mL 于 10 mL 的容量瓶中， 用水 定容 ， 分别相当于 10 g/L、 20 g/L、 100 g/L、 200 g/L、 500 g/L、 1000 g/L、 2000 g/L、 5000 g/ L、 20000 g/ L 浓度标准 工作 液 。 5 仪器 设备 5.1 分析天平：感量 0.0001 g、 0.01 g； 5.2 振荡器 ； 5.3 涡旋混合器 ； 5.4
8、荧光偏振测定仪 ： 具有荧光偏振功能的 激发波长 488 nm、发射波长 520 nm 的 设备。 5.5 定性中滤纸 ； 5.6 滤膜： 0.22 m 有机滤 膜 ； 5.7 微量移 液器 ； 5.8 分样筛： 425 m 的标准筛 。 6 试样制备 玉米 ：去除可见杂质，混匀，四分法缩分至约 300 g，粉碎后 全部通 过孔径 425 m的标准筛，取约 100 g储于食品塑料袋或玻璃广口瓶内，通风良好处常温存放，备用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取 20 g样品（准确至 0.01 g），置于 250 mL具塞三角瓶中，加入 100 mL 10mMPBS缓冲溶液（ 4.7）， 振荡器上震
9、荡 1 h。用滤纸过滤，滤液采用 0.22 m 的滤膜过滤，滤液待测定用。 7.2 测定 7.2.1 荧光偏振强度测定 在试管中依次加入 900 L 10 mM PBS缓冲溶液、 100 L伏马毒素 B1标准 工作液 或样品滤液、 100 L 抗体溶液，在涡旋混合器上混匀，放入荧光偏振测定仪中，测定。取出试管，加入 100 L伏马毒素 B1 荧光 标记物溶液，在涡旋混合器上，混匀，放入荧光偏振测定仪中，反应 1 min，测定。记录测定得到 的荧光偏振强度。 7.2.2 标准曲线绘制 将配制好的伏马毒素 B1标准 工作液（ 4.14） 按照 7.2.1测定方法测定不同浓度标准溶液的荧光偏振 强度
10、，以伏马毒素浓度（ g/mL） 荧光偏振强度（ mP）作标准曲线。 7.2.3 样品溶液的测定 DB41/T 1733 2018 3 mVcX 按照 7.2.1测定 方 法测定 样品溶液的荧光偏振强度，根据标准曲线得到待测液中 伏马毒素 B1的浓度， 样品中伏马毒素 B1浓度应在标准工作曲线浓度范围内。 8 计算 试样中伏马毒素 B1含量按式（ 1）计算 ： . （ 1） 式中： X 试 样 中伏马毒 素 B1的含量，单位为毫克每千克（ mg/kg）； c 从标准曲线上 得到的待测液中伏马毒 素 B1的质量浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； V 试 样 中加入的提取溶液体积，单位为毫 升（
11、 mL）样 ； m 试 样 的质量，单位为克 （ g）； 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字 。 9 精密度 9.1 重复性 在重复性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不 得 超过 20%。 9.2 再现性 在再现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不得超 过的 30%。 DB41/T 1733 2018 4 附 录 A (规范性附录 ) 溶 液 配 制 伏马毒素 B1荧光标记物 （ 6， -（ 4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素标记的伏马毒素 B1， 6-DTAF）的配制 称取 10 mg 伏马毒素 B1，加入 0.1mL 二甲基甲酰胺，再加入
12、 0.1 mL 0.1M Na2CO3溶液，混匀。称取 1mg 6-DTAF，加入 0.1 mL 二甲基甲酰胺，混匀。将 6-DTAF 溶液加入到伏马毒素溶液中，搅拌反应 8 h。 将反应液移入加有 0.3 g 硅胶 60（粒径 20 m 43 m，用二氯甲烷洗涤并干燥后使用）的小瓶中，用 0.4 mL 甲醇洗涤反应瓶 2 3 次，洗涤液并入小瓶中，用冷冻干燥机干燥过夜。 荧光标记物的纯化采用填充柱净化，柱填料为硅胶 60（粒径 40 m 63 m）。将约 10 g 填料溶解 于二氯甲烷中，搅拌赶除气泡后，将溶液倾倒入填充柱中，静置待填料沉淀。样品用 10 mL 甲醇溶解， 倾入柱中，分别用 50 mL 二氯甲烷和 50 mL 淋洗液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按 30:10:0.5 的比例混合） 洗涤，最后用 60 mL 洗脱液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按 30:30:1 的比例混合）洗脱，收集洗脱液。 40 水浴减压旋转蒸发近干，冷冻干燥机干燥过夜至荧光标记物为黄色粉状物。收集荧光标记物于瓶中，在 -20 条件下保存。 _
