1、ICS 11.020 C 59 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生 行 业 标 准 WS 216 2018 代替 WS 216 2008 登革热诊断 Diagnosis for dengue fever 2018-03-06 发布 2018-08-01 实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 WS 2162018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 诊断依据 . 1 4 诊断原则 . 2 5 诊断 . 2 6 鉴别诊断 . 2 附录 A（规范性附录） 登革热血清学检测方法 . 3 附录 B（规范性附录） 登革热病原学检测方法 . 10 附录
2、 C（资料性附录） 登革热的鉴别诊断 . 16 附录 D（资料性附录） 登革热的病原学、流行病学及临床表现 . 18 参考文献 . 21 WS 2162018 II 前 言 本标准 第 5章 为强制性条款 ,其余为推荐性条款。 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准代替 WS 216 2008登革热诊断标准。 本标准与 WS 216 2008相比，主要 技术 变化如下： 修改了适用 范围 （见 第 1章 ， 2008年版的 第 1章 ）； 术语和定义 删除 了 束臂试验，增加了重症登革热和 NS1抗原 （见 第 2章 ， 2008年版的 第 2章 ） ； 修改了 临床表
3、现 （见 第 3章 ， 2008年版 的 3.2）； 修改了 实验室检查 （见 第 3章 ， 2008年版的 3.3）； 删 除 了 “血液浓缩；低白蛋白血症”指标 （见 2008年 版的 3.3.3） ； 增加 了 “发病 5d内的登革病毒 NS1抗原检测阳性”指标 （见 第 3章， 2008年版的 3.3）； 修改了 疑似病例 （见 第 5章 ， 2008年版 的 5.1） ； 修改了 临床诊断病例 （见 第 5章 ， 2008年版的 5.2） ； 修改了 确诊病例（见 第 5章 ， 2008年版的 5.3） ； 增加了重症病例（见 第 5章， 2008年版的 的 5.4）； 调整了 附录
4、 A和 附录 B的 顺序 ； 附录 A中增加了“酶联免疫法检测登革病毒 NS1抗原” 方法 ，删 除 了 原有的“ 血凝抑制（ HI）试 验检测登革病毒血凝抑制抗体 ” 方法 （见附录 A和附录 B， 2008年版 的 附录 A和附录 B）； 修改了 附录 D中 内容 ，将原有的“登革出血热”和“登革休克综合征”改为“重症登革热”， 将重症登革热的高危人群和早期识别重症病例的预警指征纳入 （见附录 D， 第 5章， 2008年版的 附录 D） 。 本标准起草单位：广东省疾病预防控制中心、广州市第八人民医院、中国疾病预防控制中心病毒病 预防控制所、中国疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京地坛医
5、院、中国军事医学科学院微生物流 行病研究所。 本标准主要起草人：何剑峰、张复春、王世文、殷文武、李建东、李兴旺、秦成峰、王 建 、吴德、 邓爱萍。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： WS 216 2001； WS 216 2008。 WS 2162018 1 登革热诊断 1 范围 本标准规定了登革热的诊断 依据 、诊断原则、诊断和鉴别诊断 。 本标准适用于各级各类医疗 卫生 机构及 其医务人员对于登革热病例的诊断 。 2 术语和定义 下列 术语和定义适用于本文件。 2.1 重症登革热 severe dengue 登革热的一种严重类型，临床表现为严重出血、休克、严重脏器损伤等。 2.2 N
6、S1 抗原 NS1 antigen 登革病毒非结构蛋白中的一种糖蛋白，其大量存在于感染细胞的表面，可作为早期诊断的特异性指 标。 3 诊断依据 3.1 流行病学史 发病前 14d内 ，曾经到 过登革热流行区 ，或居住场所或工作场所周围 1个月内 曾 出现过登革热病例 。 3.2 临床表现 3.2.1 急性起病， 突 发 高 热 ， 明显疲乏 、 厌食、恶心等，常伴有 较剧烈的头痛、眼眶痛、全身肌肉痛、 骨关节痛等症状 ， 可伴面部、颈部、胸部潮红，结膜充血等。 3.2.2 皮疹：于病程第 3天 第 6天 在颜面四肢出现充血性皮疹或点状出血疹。典型皮疹为见于四肢 的针尖样出血点及“皮岛”样表现等
7、。皮疹分布于四肢躯干或头面部，多有痒感，不脱屑。持续 3 d 5 d。 3.2.3 出血倾向：部分病人可出现不同程度的出血表现，如皮下出血、注射部位瘀点、牙龈出血、鼻 衄及束臂试验阳性等。 3.2.4 严重出血：皮下血肿，肉眼血尿，消化道、胸腹腔、阴道、颅内等部位出血。 3.2.5 严重脏器损伤 ：急性心肌炎、 急性呼吸窘迫综合征 、急性肝损伤、急性 肾 功能不全 、 中枢神经 系统损伤等表现 。 WS 2162018 2 3.2.6 休克：心动过速、肢端湿冷、毛细血管充盈时间延长 3s、脉搏细弱或测不到、脉压差减小或 血压测不到等。 3.3 实验室检查 3.3.1 白细胞计数减少 和 /或血
8、小板减少 。 3.3.2 登革病毒 IgM 抗体阳性（见附录 A中 A.1、 A.2）。 3.3.3 发病 5d 内的登革 病毒 NS1抗原检测阳性（见 A.3） 。 3.3.4 登革病毒 恢复期血清特异性 IgG抗体滴度比急性期有 4 倍及以上增长 或阳转 （见 A.4、 A.5）。 3.3.5 从急性期病人血 液 、脑脊液或组织等中分离到登革病毒（见附录 B中 B.1、 B.2）。 3.3.6 应用 RT-PCR 或实时荧光定量 RT-PCR检出登革病毒核酸（见 B.3、 B.4）。 4 诊断原则 依据患者的流行病学证据、临床表现及实验室检查结果进行综合判断。 5 诊断 5.1 疑似病例
9、符合下列 一项 可诊断 为疑似病例 ： a) 符合 3.1， 并 同时 符合 3.2.1。 b) 同时 符合 3.2.1、 3.3.1。 5.2 临床诊断病例 符合下列 一项 可诊断 为临床诊断病例 ： a) 符合 5.1a），并 同时 符合 3.2.2、 3.2.3中 任一项 和 3.3.1。 b) 符合 5.1，并 同时 符合 3.3.2、 3.3.3中 任一项 。 5.3 确诊病例 符合 5.1或 5.2，并同时符合 3.3.4、 3.3.5、 3.3.6中 任一项 可诊断为确诊病例 。 5.4 重症登革热 符合 5.2或 5.3， 并同时符合 3.2.4、 3.2.5、 3.2.6中
10、任一项 可诊断重症登革热 。 6 鉴别诊断 登革热应与麻疹、风疹、猩红热、流行性感冒、基孔肯雅热、寨卡病毒病相鉴别；重症登革热应与 钩端螺旋体病、肾综合征出血热、恙虫病等相鉴别 。参见 附录 C与附录 D。 WS 2162018 3 A A 附 录 A （规范性附录） 登革热血清学检测方法 A.1 应用 IgM捕捉酶联免疫吸附试验（ Mac-ELISA）检测登革病毒 IgM抗体 A.1.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人链单克隆抗体捕获待检测血清中的 IgM，再加入特异 性抗原和相应酶标单克隆抗体，加底物显色。显色程度与特异性 IgM抗体含量呈正相关。 A.1.2 材料和试剂 所
11、需材料 和 试剂如下： a) 洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱（ 37 2） ； b) 10 L 100 L可调移液器、 10mL吸管 ； c) 稀释血清用的试管、吸水纸 ； d) 蒸馏水或去离子水 ； e) 登革病毒 IgM 抗体捕捉 ELISA诊断试剂盒 。 A.1.3 检测方法 具体步骤如下： a) 在一系列试管中，将阴、阳性对照血清，临界值较准血清和待检血清稀释成 1 100； b) 吸取所需量的纯化登革病毒抗原和等体积辣根过氧化物酶标记单克隆抗体至另一干净的玻璃 瓶或试管中，混匀后置室温作用 1h； c) 混合好标记单克隆抗体和抗原后，在 10min 内各吸取 100 L 稀释好的病
12、人标本和对照血清至 测试板上相应的微孔中， 37作用 1h； d) 弃血清，用洗涤液重复洗涤 6 次，吸水纸上扣干，分别加 100 L上述作用好的登革病毒抗原 和酶标单克隆抗体复合物， 37作用 1h； e) 弃登 革病毒抗原和酶标单克隆抗体复合物，用洗涤液重复洗涤 6次，吸水纸上扣干，每孔加入 100 L的 TMB（四甲基联苯胺），室温作用 10min充分显现蓝色后，每孔加入 100 L 的终止 液，混匀 ； f) 在 30min内于 450nm波长处读取每孔的吸光度。 A.1.4 结果判断 A.1.4.1 酶标仪读数结果判断 判断标准为：在 NC/CO 1且 PC/CO 1的情况下，若 S
13、/CO 0.9，则结果为阴性，若 S/CO 1.1，则结 果为阳性 ， 若 S/CO 0.9 1.1，则标本需重做。 注： S为待检血清的吸光度； NC为阴性对照血清的吸光度； PC为阳性对照血清的吸光度； CO为临界较准血清的吸光 度平均值。 A.1.4.2 目测法 WS 2162018 4 未加终止液前，在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下，若样品孔的颜色比临界 较准血清孔深者为阳性，样品孔的颜色比临界较准血清孔浅者为阴性。 A.1.5 意义 IgM抗体阳性，表示患者新近感染登革病毒，适用于登革 热 早期诊断。 A.2 应用间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测登革病毒 I
14、gM抗体 A.2.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化的登革病毒基因工程表达抗原包被塑料板，与稀释的待检 血清中的特异性抗体结合，其中血清 IgM部分又与后加入的酶标记的抗人 IgM结合，通过酶与底物的作用 产生可见的颜色反应，显色程度与特异性 IgM抗体含量呈正相关。 A.2.2 材料和试剂 所需材料和试剂如下： a) 洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱（ 37 2） ； b) 10 L 100 L可调移液器、 10mL吸管 ； c) 稀释血清用的试管、吸水纸 ； d) 蒸馏水或去离子水 ； e) 登革病毒 IgM 抗体酶联免疫诊断试剂盒 。 A.2.3 检测步骤 具体步骤如下： a
15、) 将检测血清用样品稀 释液做 1 50 稀释。（先将 10 L 血清加入到 90 L 的样品稀释液中混 匀，再将 1 10 的稀释血清用样品稀释液做 1 5稀释充分混匀。标本稀释后应在 2h内使用。） b) 将浓缩洗涤液加入 720mL（ 96T）蒸馏水中混匀备用。 c) 取出已包被板，加入已稀释血清 100 L/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各 2孔（阴、阳 性 对照孔分别直接加入相应对照血清 100 L/孔，空白对照加入洗涤液 100 L/孔），振荡均 匀后，于 37水浴箱温育 40min。 d) 温育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复洗涤 5次，扣干。 e
16、) 加入酶标记物 50 L/孔（空白孔不加），振荡均匀后，于 37水浴箱温育 30min。 f) 温育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复洗涤 5次，扣干。 g) 每孔加入底物 A、 B 液各 50 L， 37避光显色 10min，再加入终止液 50 L/孔，于 450nm 测 OD值。 A.2.4 结果判断 临界值（ cut-off） =0.2+阴性对照均值（ N 0.05 时，按 0.05计算） 。 样品 OD值大于临界值为阳性，样品 OD值小于临界值为阴性。样品 OD值在临界值正负 10范围内为可 疑，建议用其他方法复试。 A.2.5 意义 IgM抗体阳性， 表
17、示患者新近感染登革病毒，适用于登革 热 早期诊断。 WS 2162018 5 A.3 酶联免疫法检测登革病毒 NS1 抗原方法 A.3.1 原理 在微孔条上预包被登革病毒的单克隆抗体，该抗体可与登革热病例血清中的登革病毒中的 NS1抗原 特异性结合，再与辣根过氧化酶标记抗 NS1抗体试剂进行第二次 温育 ，当样品中存在登革病毒 NS1抗原时 将形成 “包被抗体 -NS1-酶标抗体”复合物。加入显色剂，复合物上连接的辣根过氧化物酶催化显示剂 反应，生成蓝色产物，终止反应后，变为黄色，若样品中无登革病毒 NS1抗原则不显示。 A.3.2 材料 10 L， 100 L， 200 L， 1mL移液器各
18、一把 ；温箱一台，洗 板机 一台，酶标仪一台。稀释血清用的 试管、吸水纸；蒸馏水或去离子水；登革病毒 NS1抗原酶联免疫诊断试剂盒。 A.3.3 检测步骤 具体 步骤 如下： a) 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡 30min，使用前将试剂轻轻 振荡 混匀 ； b) 配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释 ； c) 编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照 3孔，阳性对照 2孔和空白对照 1孔 ； d) 加稀释液：每孔加稀释液 50L，空白孔除外 ； e) 加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各 50L，空白孔除外 ； f) 温育：用封板膜封板后，置 37温育 60min；
19、 g) 每孔加酶标试剂 50L，空白孔除外，轻轻 振荡 混匀 ； h) 温育：用封板膜封板后，置 37温育 30min； i) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤 5遍，最后 1次尽量扣干 ； j) 显色：每孔加入显色剂 A、 B液各 50L，轻轻 振荡 混匀， 37避光显色 15min； k) 测 定：每孔加终止液 50L， 10min 内测定结果。设定酶标仪波长于 450nm 处 建议使用双 波 长 450nm/（ 600 650） nm检测 ，用空白孔调零后测定各孔 A值。 A.3.4 结果判定 临界值计算：临界值 =0.10+阴性对照孔 A值均值（阴性对照孔 A值低于 0.05者以 0
20、.05计算）。 阴性对照的正常值范围：阴性对照孔 A 0.1（若 1孔 A 0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照 0.1，应重复实验）。 阳性对照正常值范围： A 0.8。 阳性判定：样品 A值临界值者为登革病毒抗原阳性。 阴性判定：样品 A值临界值者为登革病毒抗原阴性。 A.3.5 意义 阳性结果 表示患者新近 存在 登革病毒感染， 适用于登革热早期诊断 。 A.4 用免疫荧光法（ FA/IFA）检测 登革病毒 IgG抗体 A.4.1 原理 WS 2162018 6 某些荧光素（常用异硫氰酸荧光素）能与抗体蛋白分子结合，而不丧失抗体活力，仍能和相应的抗 原发生特异免疫反应，产生免疫复合物，
21、这种复合物由于有荧光色素的参与，在荧光显微镜下显示荧光， 表明有特异性抗原存在。直接免疫荧光法可用于检测感染细胞内的特异性抗原，间接免疫荧光法可查待 检血清中的特异性抗体。 A.4.2 仪器与试剂 所需仪器与试剂如下： a) 10 L 100 L， 100 L 1000 L可调移液器各 1支 ； b) 登革病毒 1 4 型抗原片（登革标准毒株感染 BHK、 Vero或 C6/36 细胞制备，低温干燥保存） 及相应单克隆抗体（阳性对照） 、阴性血清 ； c) 羊抗人（兔抗人） IgG荧光抗体 ； d) 待检患者血清（急性期和恢复期） ； e) 常用稀释液： pH7.2 7.4PBS、伊文斯兰、封
22、片胶等 ； f) 荧光显微镜 。 A.4.3 检测步骤 具体步骤如下： a) 取出抗原片，冷风吹干 ； b) 用 pH7.2 7.4PBS 稀释待检血清，从 1 20开始，对倍稀释至所需稀释度 ； c) 用移液器依次从高稀释度向低稀释度逐个加入稀释的待检血清于四个型的登革病毒抗原片孔 中，每型各加 2孔待检系列稀释血清，血清量以完全覆盖抗原面而不溢出孔外为准，置湿盒内， 在 37水浴孵育 30min（每次试验同时作阴、阳性对照） ； d) 用 pH7.2 7.4PBS 漂洗 3次，每次约 30s 1min，再用蒸馏水洗 1次，冷风吹干 ； e) 用 pH7.2 7.4PBS 稀释荧光抗体，使其
23、内含 2个工作单位和 1 8000伊文斯兰的荧光抗体，加 入各孔中，使完全覆盖抗原面，置湿盒中， 37水浴作用 30min，取出，同上漂洗及吹干 ； f) 用封片胶（或甘油缓冲液）封片，荧光显微镜观察结果。 A.4.4 结果判断 特异性荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比 例可将荧光反应大致区分为“ + +”，无荧光者为“”。检测抗体滴度时，以特异荧光达“ +” 最高血清稀释度的倒数表示。 A.4.5 意义 阳性 结果只能说明受检者可能曾 存在 登革病毒感染，但血清抗体效价达 1 80或以上者有诊断参考 意义，若恢复期血清抗体效价比急性期血清抗体效价
24、有 4倍或以上增长可确诊最近 存在 登革病毒感染。 A.5 中和试验（ NT） A.5.1 原理 当人体感染登革病毒后，血清中可产生保护性的中和抗体，登革病毒与这种特异性抗体作用后，能 被特异性地“中和”，抑制登革病毒的复制与繁殖，使其失去感染能力。中和试验包括动物中和试验、 WS 2162018 7 组织培养中和试验和空斑减少中和试验三种，每种中和试验又分为固定病毒稀释血清法和固定血清稀释 病 毒法 两 种。 动物中和试验由于需要特殊的感染动物房，一般的实验室很难做到，所以更多的实验室采用的是组 织培养中和试验和空斑减少中和试验，其中空斑减少中和试验比组织培养中和试验更敏感、特异，但由 于前
25、者对操作技术的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑时间长，对细胞覆盖培养基的要求也高，故一般 实验室多用的是组织培养中和试验。 A.5.2 仪器与试剂 所需仪器与试剂如下： a) 50 L 200 L、 1mL 可调移液器， 200 L、 1mL 无菌吸头 ； b) 无菌细胞吹打管、吸管 ； c) 无菌平底微量 96 孔组织培养板 ； d) 无菌 1.5mL 塑料离心管、冰盒 ； e) 登革病毒 1 4型标准毒株、 C6/36细胞、阳性和阴性对照血清 ； f) CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 ； g) 生长液（ 200mL）： Eagles MEM溶液 174mL， 3 谷氨酰胺 2mL， 1
26、万单位青链霉素 2mL， 7.5 碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 20mL，临用前配制混匀 ； h) 维持液的配制（ 200mL）： Eagles MEM溶液 190mL， 3 谷氨酰胺 2mL， 1万单位青链霉素 2mL， 7.5 碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 4mL，临用前配制混匀。 A.5.3 检测步骤 A.5.3.1 病毒滴度 测定 具体步骤如下： a) 病毒悬液制备与保存：将新鲜传代收获的登革病毒 1 4型标准毒株的组织培养病毒悬液或 乳 小白 鼠 脑组织制备的病毒悬液，经离心沉淀后吸出上清液，加入 20 无抗体小牛血清后分装 于细胞冻存管，迅速放入 70以下冰箱保存。 b) 病毒
27、接种：每型登革病毒各取出 1小管冰冻的病毒，在冷水中迅速溶化，用维持液将各型病毒 分别做 10 倍稀释，从 10-2到 10-7，用无菌 1.5mL 塑料离心管在冰盒上进行。每个稀释度病毒 加 4孔，每孔加 50 L，然后每孔加入 C6/36细胞（浓度为 1 106/mL） 50 L，置 CO2 培养箱 内培养，温度 33， 湿度 80 。每 天 观察细胞病变，共观察 7d，记录观察结果。 c) TCID50的计算：根据细胞病变计算 TCID50，见表 A.1。 表 A.1 TCID50的计算 病毒稀释 度 细胞病变孔数 / 接种数 细胞病变分布 累计 比数 细胞病变百 分比 % （）孔 （）
28、孔 （）孔 （）孔 10-3 4/4 4 0 9 0 9/9 100 10-4 3/4 3 1 5 1 5/6 83 10-5 2/4 2 2 2 3 2/5 40 10-6 0/4 0 4 0 7 0/7 0 WS 2162018 8 在这个例子中，能引起 50 的组织培养板出现细胞病变的病毒稀释度在 10-5和 10-6之间，计算如下： 距离比例 =（高于 50%的细胞病变百分数 -50）（高于 50%的细胞病变百分数 -低于 50%的细胞病变百 分数） =（ 83-50）（ 83-40） =0.7 距离比例与高于 50%细胞病变稀释度的对数相加即为 TCID50（ 10-4.7）。由此得
29、出 100TCID50为 10-2.7。 A.5.3.2 组织培养中和试验（固定病毒稀释血清法） 具体步骤如下： a) 将待测血清做系列倍比稀释， 1 2， 1 4， 1 8， 1 16， 1 32根据估计的血清效价决定 稀释倍数，用无菌 1.5mL塑料离心管在冰盒上进行 。 b) 将上述测定好的病毒稀释成 100TCID50/0.2mL，用无菌 1.5mL 塑料离心管在冰盒上进行 。 c) 将稀释好的血清与稀释好的病毒悬液各取等量混匀，用无菌 1.5mL 塑料离心管在冰盒上进行， 置 37水浴中作用 1h。 d) 在平底微量 96孔组织培养板上，每个稀释度病毒加 4孔，每孔加 50 L，然后
30、每孔加入 C6/36 细胞（浓度为 1 106/mL） 50 L，置 CO2培养箱内培养，温度 33，湿度 80 。每 天 观察细 胞病变，共观察 7d，记录观察结果。 e) 50 血清中和终点的计算。根据细胞病变计算 50 血清中和终点，即能保护 50 组织培养管 不产生病变的血清稀释度，计算方法见表 A.2。 表 A.2 50 血清中和终点的计算 血清 稀释度 细胞病变 孔数 /接 种数 细胞病变分布 累计 比数 百分 比 % （）孔 （）孔 （）孔 （）孔 14 （ 10-0.6） 0/4 0 4 0 16 0/16 0 18 （ 10-0.9） 0/4 0 4 0 12 0/12 0
31、116 （ 10-1.2） 0/4 0 4 0 8 0/8 0 132 （ 10-1.5） 1/4 1 3 1 4 1/5 20 164 （ 10-1.8） 3/4 3 1 4 1 4/5 80 1128 （ 10-2.1） 4/4 4 0 8 0 8/8 100 上述例子能保护 50 的组织培养细胞孔不致细胞病变的血清稀释度在 1 32 1 64之间，具体计算 如下： 距离比例（ 50 低于 50 的病变率）（高于 50 的病变率低于 50 的病变率）（ 50 20） （ 80 20） 30 60 0.5 低于 50 病变率血清稀释度的对数距离比例乘稀释系数的对数 1.5 0.5（ 0.3）
32、 = 1.5 （ 0.15） = 1.65， 1.65的反对数 1/45 即 1 45的血清可保护 50 细胞不产生病变。 A.5.4 意义 中和试验是登革病毒血清学诊断上最特异、最敏感的方法。既往感染过登革病毒的人在检测不到 HI 抗体时也可检出中和抗体。初次感染登革病毒可用中和试验进行登革病毒四种血清型别区分鉴定。恢复 期血清中可见到相应的单一型别反应。第二或第三次感染，不能用中和试验进行血清型别鉴定。 WS 2162018 9 A.6 应用间接酶联免疫吸附试验（ ELISA）检测登革病毒 IgG抗体 A.6.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化的登革病毒基因工程表达抗原包被塑料
33、板，与稀释的待检 血清中的特异性抗体结合，其中血清 IgG部分又与后加入的酶标记的抗人 IgG结合，通过酶与底物的作用 产生可见的颜色反应，显色程度与特异性 IgG抗体含量呈正相关。 A.6.2 材料 与 试剂 所需材料与试剂如下： a) 洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱（ 37 2） ； b) 10 L 100 L可调移液器、 10mL吸管 ； c) 稀释血清用的试管、吸水纸 ； d) 蒸馏水或去离子水 ； e) 登革病毒 IgG 抗体酶联免疫诊断试剂盒 。 A.6.3 检测步骤 具体步骤如下： a) 将检测血清用样品稀释液做 1 50稀释。（先将 10 L血清加入到 90 L的样品稀释液中
34、混匀， 再将 1 10的稀释血清用样品稀释液做 1 5稀释充分混匀，标本稀释后应在 2h内使用）。 b) 将浓缩洗涤液加入 720mL（ 96T）蒸馏水中混匀备用。 c) 取出已包被板，加入已稀释血清 100 L /孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各 2 孔（阴、 阳性对照孔分别直接加入相应对照血清 100 L/孔，空白对照加入洗涤液 100 L/孔），振荡 均匀后，于 37水浴箱温育 40min。 d) 温育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复 洗涤 5次，扣干。 e) 加入酶标记物 50 L/孔（空白孔不加），振荡均匀后，于 37水浴箱温育 30min。 f) 温
35、育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复洗涤 5次，扣干。 g) 每孔加入底物 A、 B 液各 50 L， 37避光显色 10min，再加入终止液 50 L/孔，于 450nm 测 OD值。 A.6.4 结果判断 临界值（ cut-off） =0.150+阴性对照均值（ N 0.05 时，按 0.05计算） 。 样品 OD值大于临界值为阳性，样品 OD值小于临界值为阴性。样品 OD值在临界值正负 10范围内为可 疑，建议用其他方法复试。 A.6.5 意义 病人 恢复期血清比急性期血清 IgG抗体滴度有 4倍 及 以上升高，可确诊感染，单份血清检测一般表明 其曾 存在 登
36、革病毒感染，但抗体滴度大于等于 1 320时，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近 存在 病毒感染。 WS 2162018 10 B B 附 录 B （规范性附录） 登革热病原学检测方法 B.1 C6/36 白纹伊蚊细胞分离登革病毒 B.1.1 原理 登革病毒是一种具有严格的细胞内存活的生物，必须生活在活的细胞组织内， C6/36白纹伊蚊细胞 对登革病毒十分敏感，根据观察病毒对其产生的变化（病变等现象）和应用特异、敏感的检测技术，检 出病毒的存在和型别。 B.1.2 仪器 与 试剂 所需 仪器与试剂如下： a) 50 L 200 L、 1mL 可调移液器， 200 L、 1mL无菌吸头 ；
37、 b) 无菌细胞吹打管、吸管 ； c) 无菌平底微量 96 孔 /24孔组织培养板或细胞管 ； d) C6/36细胞 ； e) CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 ； f) 生长液（ 200mL）： Eagles MEM溶液 174mL， 3 谷氨酰胺 2mL， 1万单位青链霉素 2mL， 7.5 碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 20mL，用前混匀 ； g) 维持液的配制（ 200mL）： Eagles MEM溶液 190mL， 3 谷氨酰胺 2mL， 1万单位青链霉素 2mL， 7.5 碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 4mL，用前混匀 ； h) 标本处理液（ 100mL）： Eagles
38、MEM 溶液 90mL， 50g/mL 庆大霉素 100 L， 1000g/mL 两性 霉素 B1mL和 1000U/mL青链霉素 1mL，小牛血清 2mL，用 7.5 碳酸氢钠溶液调至 pH7.2，用前 混匀。 B.1.3 标本的采集及处理 具体步骤如下： a) 患者：无菌采集发病后 5d 内静脉血 3mL，放冰壶送实验室分离血清，接种组织细胞培养，不 能及时接种的，将血清置 -20保存 ； b) 尸体标本：可取血、脑脊液、脑组织、肝等 ； c) 蚊：采集吸过血的埃及伊蚊，白纹伊蚊或其 他 可疑蚊种，用 0.50mol/L（ 10）葡萄糖液喂养， 至胃血完全消化后置 -20，待死后按蚊种及捕
39、获地点分组，以 10 只 20 只一组为宜，经生 理盐水冲洗数次后，转入研磨器 ,加 1mL 标本处理液，研碎均匀，置预冷 4 的离心机上， 10000r/min 离心 10min，取上清液于 4作用 2h处理后接种 C6/36细胞。 B.1.4 病毒分离 C6/36（白纹伊蚊纯系细胞株）传代细胞长成单层后（在 25cm2细胞瓶、细胞管、 24孔细胞培养板等）， 倒去细胞生长液换成细胞维持液，如果传代后立即接种，可用细胞生长液，在 25cm2细胞瓶接种患者 血 清 20 L，细胞管和 24孔细胞培养板各接种 3 L，蚊悬液或组织悬液根据浓度取接种量，加样后适度混 WS 2162018 11 匀
40、，置 35、 CO2培养箱静止培养，观察 7d，若细胞出现膨大至融合，折光度增强、颗粒增多等现象， 取细胞悬液用荧光 PCR检测登革病毒核酸（不需提取病毒 RNA），若 7d后细胞不出现病变，需盲传 1代 2 代，仍不出现病变者经核酸检测，阴性者作阴性报告。 B.1.5 间接免疫荧光试验（ FA/IFA）鉴定登革病毒 B.1.5.1 试验方法 具体步骤如下： a) 细胞片的制备：把出现“ +”病变的 C6/36 细胞管倒去维持液（若不出现病变，则需培养 7d 再制片） ，用 pH7.2PBS 洗 2 次后加 PBS3mL，用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散， 2000r/min 离心 5min，弃
41、去 PBS，加 0.2mL PBS 把沉渣吹散，滴加在 10 孔的载玻片各孔中，冷风吹干， 加冷丙酮固定 10min，用 PBS冲洗 2次，蒸馏水漂洗 1次，冷风吹干， -20保存。正常 C6/36 细胞对照按同法制片 ； b) 试验方法：取出保存的待鉴定细胞片或脑组织片，冷风吹干，于各孔中按顺序滴加 4 个型登革 病毒使用单位的单克隆抗体，各型 2 孔，对照 2孔滴加 PBS，置湿盒内 37水浴 30min，取出 用 PBS冲洗 3次，蒸馏水漂洗 1次 ，冷风吹干，滴加含 130 mol/L（ 1 8000）伊文思蓝的 2 单位抗鼠 IgG 荧光抗体，置湿盒内 37水浴 30min，用 PB
42、S冲洗 3次，蒸馏水漂洗 1 次，冷风 吹干，用甘油缓冲液封片，镜检，记录结果。 B.1.5.2 结果判断 特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内，正常组织细胞被染成橙红色或暗红。 B.1.5.3 意义 从病人血液、组织或蚊媒中分离出登革病毒， 可确诊存在登革病毒感染， 经鉴定， 可 确定 病毒型别。 B.2 应用乳小白鼠分离登革病毒 B.2.1 原理 新生小白鼠对登革病毒十分敏感，根据观察病毒对其产生的致病等现象和应用特异、敏感的检测技 术，检出病毒的存在和型别。 B.2.2 仪器和试剂 参考 B.1.2。 C6/36白纹伊蚊细胞改用 1日龄 3日龄乳小白鼠。 B.2.3 标本采
43、集及处理 见 B.1.3。 B.2.4 病毒分离 每一标本接种一窝 1日龄 3日龄小白鼠，每只脑内接种全血或 1 10血清或蚊悬液、组织悬液 10 L 20 L，接种后 48h内死亡者作非特异性死亡，弃去。存活者观察至 10d左右仍未发病时，剖取其中 2 只，取脑，用 pH8.0肉汤制成 10悬液，盲传 1日龄 3日龄小白鼠一窝，其余的及盲传的均观察至第四 周，未发病作阴性结果。在观察期内若发病（松毛、蜷缩、活动力降低、站立不稳、抽搐、离群、不进 食、瘫痪等症状）则剖取半边脑，按盲传法制成 10鼠脑悬液，转种 1日龄 3日龄小白鼠，并作无菌试 WS 2162018 12 验，另一半脑置 5.4
44、3mol/L（ 50）甘油缓冲液中低温保存。无菌试验阴性而仍出现以上症状的乳鼠作 为可疑毒株传代、保种，并进行鉴定。 B.2.5 病毒鉴定 具体 步骤和方法如下： a) 脑组织片的制备：取发病濒死的小鼠脑组织以冰冻切片制成 10 孔组织片，经冷风吹干，冷丙 酮固定 10min，冲洗、吹干后放 -20保存。正常脑组织同法制作。 b) 试验方法、结果和意义：参考 B.1.5。 B.3 RT-PCR技术检测登革病毒 RNA及型别鉴定 B.3.1 原理 PCR技术（聚合酶链反应）是利用双链 DNA分子碱基配对原则，在一定条件下扩增 DNA片段的体外扩 增方法。它的特异性取决于两个人工合成的寡核苷酸引物
45、的序列，引物与待扩增片段两条链两段 DNA序 列分别互补，待扩增 DNA在变性温度下分解为二条单链模板，在复性温度引物与模板两端的 DNA序列分别 复性（杂交 -碱基配对），在延伸温度和单核苷酸存在的条件下，由 TaqDNA聚合酶催化，引导引物的 5 端向 3 端方向延伸合成新链，是一个重复进行的热变性复性延伸的温控循环过程，随着循环次数的增 加， DNA产量呈指数上升，经过 20个循环以后，从微量基因材料，特异性地扩增可达数百万倍。登革病 毒含 RNA基因组，因此 PCR前需经过逆转录酶作用，合成第一条 cDNA链（ RT），再进行扩增（ PCR），即 RT-PCR。设计一对通用引物可扩增登
46、革病毒组基因。设计不同型登革病毒的引物对，可扩增出不同的血 清型病毒的基因产物。根据基因扩增产物的片段大小可判断是否登革病毒或某一型登革病毒。 B.3.2 设备和试剂 B.3.2.1 设备 移液器（ 10 L、 20 L、 100 L、 200 L、 1000 L）及配套吸头、离心管（ 1.5mL、 0.2mL）及管 架、台式高速离心机、普通冰箱、旋涡混合器、电泳仪及电泳槽、微波炉、 PCR仪、紫外分析仪等。 B.3.2.2 试剂 随机引物、登革病毒特异性引物、 RNA提取试剂、 AMV逆转录试剂盒、 PCR试剂盒、 10 Tris-硼酸（ TBE） 缓冲液（ 108gTris粉， 9.3g依地酸二钠 EDTA Na2， 55g硼酸，完全溶解后用 HCl调 pH至 8.0，加水至 1000mL， 用前稀释成 0.5倍 或 1倍）、加样缓冲液（ 0.5溴酚蓝和体积比为 40的蔗糖溶于水 后，分装于 4保存
