1、ICS 11.020 C 05 WS 中华人民共和国 卫生行业 标准 WS/T 594 2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱 酯酶等位基因检测 法 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica 2018 - 03 - 01 发布 2018 - 08 - 01 实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T 594 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2
2、009给出的规则起草。 本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预 防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行 病研究所、上海市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人 ：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷 培恩。 WS/T 594 2018 1 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1 范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。 本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第 342氨基酸位点基因型的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3、。 2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因 ace编码。 2.2 等位基因 allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。 2.3 342G、 342V 和 342A 342G、 342V和 342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第 342氨基酸残基位点上的氨基酸为 甘氨酸（ Gly）、 缬氨酸（ Val）和丙氨酸（ Ala）。 3 样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在 100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在 4 条件下短期（ 6个月 内 ）保存，可在 -20 以下长期保存。 4 引物
4、 引物 F的序列为 CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物 R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。 引物设计参照 附 录 A。 配制为 10 mol/L浓度，保存于 -20 冰柜 。 5 仪器设备 5.1 PCR（ 聚合酶链式反应） 仪。 5.2 琼脂糖凝胶电泳仪。 WS/T 594 2018 2 5.3 凝胶成像仪。 5.4 恒温水浴锅。 6 主要试剂 6.1 DNA聚合酶（ Taq酶 ）。 6.2 限制性内切酶 Bsp1286I。 6.3 限制性内切酶 Eae I。 7 操作步骤 7.1 在 PCR 管中加入 10PCR 缓冲液 (含 100 mmol/L Tri
5、s-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2) 2.5 L， dNTP（ 2.5 mmol/L） 2.0 L，引物 F 0.5 L，引物 R 0.5 L，单头家蝇的基因组 DNA 1 L （ 100 ng 300 ng，提取方法可参见附录 B，也可用商售的 DNA 提取试剂盒或其 他 类似方法提取）和 Taq 酶 (2 5 个单位 )，用灭菌水补齐至 25 L，混匀。 7.2 将 PCR 管放入 PCR 仪中，设置 PCR 反应程序为： 94 3 min； 94 30 s， 50 30 s， 72 30 s， 35 个循环； 72 10 min。运行程序。 7.
6、3 PCR 运行结束后，取 5 L PCR 产物在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在 160 V，电泳 20 min 后在紫外光下检测，有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR 产物用于进行以下酶切反应。 7.4 取合格样品（即电泳检测产物为 609bp）的 PCR 产物设置两个酶切反应，反应 A 用 Bsp1286I 酶、 反应 B 用 Eae I 酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录 C）。 7.5 将酶切后的产物上样在 1.5% 的琼脂糖凝胶上，电压设定在 160 V，电泳 20 min 后在紫外光下检 测。 8 基因型确定 根据酶切产物的电泳
7、结果 （ 参见附录 D） ，确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型 ， 见表 1。 表 1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应 I ( 加 Bsp1286I 酶切 ) 反应 II (加 Eae I 酶切 ) 乙酰胆碱酯酶 342 氨基酸位点基因型 361bp 、 248bp 609bp 敏感型纯合子 （ G/G） 609bp 609bp 不敏感 I 型纯合子（ V/V） 609bp 361bp、 248bp 不敏感 II 型纯合子（ A/A） 609bp、 361bp、 248bp 609bp 不敏感 I 型 /敏感型杂合子（ G/V） 609bp、 361bp、 248bp 609bp、 3
8、61bp、 248bp 不敏感 II 型 /敏感型杂 合子 （ G/A ） 609bp 609bp、 361bp、 248bp 不敏感 I 型 /不敏感 II 型杂合子（ V/A ） 注： G 表示氨基酸残基为 Gly（甘氨酸）； V 表示氨基酸残基为 Val（缬氨酸） ； A 表示氨基酸残基为 Aal（丙 氨酸）。 WS/T 594 2018 3 A A 附 录 A （资料性附录） 引物设计参照序列 342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTT
9、CACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG 342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 3
10、42V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA 342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGC
11、GTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA 342G CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA 342V GTCGGTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342A GTCGGCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342G GTCGGGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342V TA
12、AAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAAT
13、TTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342G ATTTATGCGATTACACGAATTATTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCGGCTTCTTTGTGT 342V TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342A TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342G TTTCAACTTAGGAAAATCCCCAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342V CAATTTCT
14、GTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA 342A CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA 342G CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTTTCCCTCGGCCCCAA 342V CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA WS/T 594 2018 4 342A CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGA
15、TCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA 342G CTATAGATGGTGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA 342V GCGGTTACG 342A GCGGTTACG 342G GCGGTTACG 注： 下划线分别对应上游引物与下游引物序列 (反向互补 )； 方框内为编码 342位氨基酸的密码子。 WS/T 594 2018 5 B B 附 录 B （资料性附录） 家蝇基因组 DNA 提取方法 B.1 取单头家蝇，去除腹部后置于 1.5mL体积的离心管 (eppendorf 管 ) 中，加入 0.5 mL
16、 新鲜配制的 裂解液（含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0， 10 mmol/L EDTA， 50 mmol/L NaCl, 1% SDS， 0.15 mmol/L 精胺 ， 0.5 mmol/L 亚精胺 和 2 U/mL的蛋白酶 K），碾磨将虫体捣碎，置 60 温浴， 20 min后取出。 B.2 加入 75 L的 8 M醋酸钾 ，混匀，置冰上 10 min。 B.3 14000 g 离心 5 min， 取 400 L上清液转至新的离心管。 B.4 加入 800 L 冰冷的 100%乙醇，室温放置 10 min B.5 离心 10 min，弃上清，离心沉淀用 500 L的
17、 70%乙醇清洗。 B.6 离心 5 min，沉淀干燥后（可置超净台中，开通风），加入 50 L灭菌水或 TE缓冲液 （ 10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA， pH=8.0） 中 溶解。 提取 的 DNA样品可直接用于 PCR。样品 保存 4 备用，也可于 -20 中长期保存。 WS/T 594 2018 6 C C 附 录 C （资料性附录） 酶切体系设置范例 C.1 酶切反应体系的设置见表 C.1。 表 C.1 酶切反应体系 成分 10NEBuffer 4 100BSA Bsp1286I Eae I PCR产物 灭菌水 反 应 A 2 L 0.5 L 0.5
18、 L 0 1 g 补至 20 L 反应 B 2 L 0 0 0.5 L 1 g 补至 20 L 注 ： 采用限制性内切酶 Bsp1286I， EaeI。 10 NEBuffer 4和 100 BSA随酶提供，其中 1 NEBuffer 4 含 50 mmol/L KAc， 20 mmol/L Tris-Ac， 10 mmol/L Mg(Ac)2， 1 mmol/L DDT， pH7.9 (25 测定 )， 100 BSA 成分为 10 mg/mL的 BSA (牛血清白蛋白 )。 C.2 37 下进行温浴，时间 2h 4h，反应结束，直接用于电泳检测。 WS/T 594 2018 7 D D 附
19、 录 D （资料性附录） 家蝇乙酰胆碱酯酶 342 位点不同基因型 PCR 产物的酶切结果 家蝇乙酰胆碱酯酶 342位点不同基因型的 PCR产物酶切 结果 见图 D.1。 G 氨基酸残基为 Gly（甘氨酸）； V 氨基酸残基为 Val（缬氨酸） ； A 氨基酸残基为 Aal（丙氨酸） ； G/G 敏感型纯合子； V/V 不敏感 I型纯合子； A/A 不敏感 II型纯合子； G/V 不敏感 I型 /敏感型杂合子； G/A 不敏感 II型 /敏感型杂合子； V/A 不敏感 I型 /不敏感 II型杂合子 ； 1 Bsp1286I酶切产物图； 2 EaeI酶切产物图。 注： 最右侧道为 DNA分子量标记。 图 D.1 家 蝇乙酰胆碱酯酶 342位点不同基因型 PCR产物的酶切结果 _
