1、DB61/T 1472.32021I目 次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14生产条件.25生产工艺.36合格指标.47检验.58标识、贮存.5附录 A（规范性）常用摇瓶种培养基配方.6附录 B（规范性）常用发酵罐培养基配方.7附录 C（规范性）检验项目.8附录 D（规范性）检验培养基.9DB61/T 1472.32021II前 言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本文件灵芝生产技术规范分为五个部分：第1部分：产地环境第2部分：菌种第3部分：液体菌种生产技术第4部分：袋料栽培技术第5部分：段木栽培技术本
2、文件为DB 61/T 1472.32021的第3部分。本文件由陕西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：陕西省微生物研究所、杨凌康宇生物科技有限公司、陕西国人菌业科技产业园有限公司、陕西省园艺技术工作站、西安市质量与标准化研究院、陕西崇德生物技术发展有限公司。本文件主要起草人：雷萍、吴亚召、张文隽、马婧嘉、王周平、渠敬峰、陈磊、霍国琴、王磊、王迁、陈惠、马莹、钱磊。本文件由陕西省微生物研究所负责解释。本文件首次发布。联系信息如下：单位：陕西省微生物研究所地址：西安市雁塔区西影路76号邮编：710043电话:029-82357027DB61/T 1472.320211灵芝生产技术规范 第 3
3、部分：液体菌种生产技术1范围本文件规定了食用灵芝液体菌种的术语与定义、生产条件、生产工艺、合格指标、检验及标识贮存。本文件适用于食用灵芝液体菌种的生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 150.2压力容器 第 2 部分：材料GB 5749生活引用水卫生标准GB/T 12728食用菌术语GB/T 14295空气过滤器NY/T 528食用菌菌种生产技术规程NY/T 1284食用菌菌种中杂菌及害虫的检验NY 5099无公害食品 食
4、用菌栽培基质安全技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1液体菌种liquid spawn培养基为液体状态的菌种。来源：GB/T 12728-2006,2.5.303.2食用菌液体菌种培养器cultivation apparatus for edible fungus liquid spawn也称液体菌种培养罐，是指进行食用菌液体菌种培养的专用设备，包括固定式和可移动式两种类型。要求不锈钢材质，符合GB 150.2钢制压力容器标准。3.3食用菌液体菌种接种器edible fungus-liquid interface trap inoculators将液体菌种从培养器中按无菌操作要
5、求转接到食用菌固体培养基物料上的设备。3.4DB61/T 1472.320212空气压缩机air compressor能为培养器提供压缩空气的设备。3.5空气过滤器air filter采用过滤、黏附或荷电捕集等方法去除空气中颗粒物的设备。来源：GB/T 14295-2019,3.13.6接种量inoculation amount接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比表示。4生产条件4.1技术人员应具有与所生产的菌种级别相适应的食用菌菌种生产经营许可证、食用菌菌种生产技术人员证和食用菌菌种检验员证的人员。4.2生产场地应符合灵芝生产技术规范 第1部分：产地环境4栽培环境的要求。
6、4.3生产厂房4.3.1生产车间电力充足，水源方便，通风良好。地面、墙壁和天花板应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，地面应有1.0 1.5 的排水坡度和良好的排水系统。4.3.2接种间应设置缓冲间及与职工人数相适应的更衣室。缓冲间内放置封闭式废物桶，安装排风设备，门窗应设置防蚊蝇纱网。入口处设置非手动洗手装置、消毒和干手设施。4.3.3发酵培养室内壁和房顶光滑易清洗和消毒。4.4设施设备4.4.1应配置液体菌种培养器、液体菌种接种器、空气压缩机、空气过滤器、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温回旋式振荡器、恒温培养箱、冰箱、显微镜、磁力搅拌机、磅秤、天平、酸度计及其它相关器具。4.4.2冷却室
7、、接种室、培养室和贮存室均应具备调温设施。4.5培养基质应符合NY 5099的规定。DB61/T 1472.3202134.6菌种选择4.6.1选用高产、优质、抗逆性强、商品性能良好的灵芝品种。4.6.2菌种生产过程应符合 NY/T 528 的要求。5生产工艺5.1工艺流程母种摇瓶种液体菌种培养器检查、清洗与空灭投料与定容灭菌冷却接种液体菌种发酵菌种检测5.2母种制备母种制备应符合NY/T 528的要求。5.3摇瓶种制备5.3.1培养基按照附录A规定配制培养基。5.3.2装液量采用500 mL1000 mL的三角瓶，每瓶装液量为三角瓶体积的1/4，八层纱布和牛皮纸封口。5.3.3灭菌压力达到0
8、.105 MPa0.15 MPa，温度121 126，保持30 min。5.3.4接种将灭菌后的培养基冷却至30 以下，无菌条件下每瓶接入0.5 cm左右大小的母种3 块6 块。5.3.5培养培养温度26 2，摇床振荡频率100 r/min150 r/min，培养4 d5 d。5.3.6移种标准5.3.6.1菌体形态：菌丝长分支、菌丝壁上易见“芽头与锁状联合”，发酵液清香，菌丝球多、小颗粒状，大小均匀，菌液稍有黏稠。5.3.6.2菌丝量：10 15（湿重）。5.3.6.3酸碱度：发酵液 pH2.53.0。5.3.6.4镜检：平皿检验无杂菌。5.4发酵5.4.1投料前准备5.4.1.1检查液体菌
9、种培养器上全部阀门、压力表，要求完好，工作正常。5.4.1.2对液体菌种培养器罐体内、外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。DB61/T 1472.3202145.4.1.3在液体菌种培养器罐体夹层加水，方法是用硅胶软管连接水管和罐体下部的加水口，同时打开夹层放水阀进行加水，水量加至放水阀开始出水即可。水质应符合 GB 5749 的规定。5.4.2培养基按照附录B规定配制。5.4.3装液量装液量为罐体容积的60。5.4.4灭菌液体菌种培养器内蒸汽压力达到0.105 Mpa0.15 Mpa，温度达到121 126，保持40 min60min。5.4.5接种在无
10、菌条件下，接种量为投料量的10。5.4.6培养培养要求具体要求如下：a)罐压：0.03 Mpa0.05 Mpa；b)罐温：26 2；c)通气量：11V/(Vmin)；d)搅拌转速：150 r/min180 r/min；e)培养时间：96 h120 h。5.5检测接种后第4 d进行检测，按照无菌操作取样，将样液接于PDA培养基的斜面或培养皿上，于28 恒温培养2 d5 d，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无杂菌污染。若无细菌、霉菌等杂菌菌落生长，则表明该样品无杂菌污染。6合格指标6.1感官要求6.1.1色泽：球状带“毛刺”菌丝体呈白色，菌液呈淡黄色。6.1.2菌液形态：菌液稍粘稠，有大量球状
11、带“毛刺”菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液体不浑浊。6.1.3菌液气味：有灵芝菌液体培养时特有的气味，无异味。6.2理化指标6.2.1酸碱度：pH5.56.0。6.2.2菌丝量：菌丝湿重（%）8。6.2.3显微镜下菌丝形态：球状和丝状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，菌丝内原生质分布均匀，染色剂着色深。有明显锁状联合。DB61/T 1472.3202156.2.4杂菌及害虫：无杂菌、无害虫。7检验7.1留样母种应以每个批号3 支5 支，于4 6 条件下贮存至栽培袋正常发菌；摇瓶种使用时取样30mL40 mL，用无菌三角瓶留存；发酵罐实消后的空白培养基取样30 mL40 mL，
12、用无菌三角瓶留存；放罐前48 h从发酵罐中取样30 mL40 mL，用无菌三角瓶留存；发酵终止后取样2份，每份80 mL100mL，1份用于出厂检验，1份用无菌三角瓶留存，7.2检验检验项目、指标、方法见附录C。8标识、贮存8.1标识生产的菌种必须贴有菌种质量合格标识，注明菌种种类、品种、生产单位、接种日期。8.2贮存8.2.1摇瓶种保存2 4、暗光条件下可保存5 d7 d。8.2.2液体菌种保存在培养器内通入无菌空气，保持罐压0.02 Mpa0.04 Mpa，液温6 10 可保存3 d，11 15 可保存2 d。DB61/T 1472.320216AA附录A（规范性）常用摇瓶种培养基配方A.
13、1玉米粉（或玉米淀粉）1，蔗糖 2，蛋白胨 0.2，酵母粉 0.3 0.5，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁 0.06。A.2淀粉 2，葡萄糖 2，黄豆粉 2，蛋白胨 0.2，硫酸铵 0.2，氯化钠 0.25，磷酸二氢钾 0.05，碳酸钙 5。DB61/T 1472.320217BB附录B（规范性）常用发酵罐培养基配方B.1黄豆粉 3，葡萄糖 4，蛋白胨 0.2，硫酸铵 0.2，氯化钠 0.25，磷酸二氢钾 0.1%。B.2玉米粉 1，蔗糖 2，酵母粉 0.2，磷酸二氢钾 0.01，硫酸铵 0.2。B.3豆饼粉 1，蔗糖 2，磷酸二氢钾 0.075，硫酸镁 0.03。B.4玉米粉 2 3，蔗糖 2，硫
14、酸铵 0.25，磷酸二氢钾 0.15，硫酸镁 0.07，碳酸钙 0.2。DB61/T 1472.320218CC附录C（规范性）检验项目C.1检验项目见表C.1。表 C.1检验项目项目指标检验方法菌液颜色和透明度球状带“毛刺”菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色，清澈透明肉眼观察菌液形态菌液稍粘稠，静置基本不分层；菌丝体稠密，菌球悬浮力好、在菌液中分布均匀，菌球大小均匀，菌球间液体不浑浊肉眼观察菌液气味无异味，如酸、臭味、发酵酒精味等。发酵罐排气口气味正常，有灵芝菌液体培养时特有的气味鼻嗅酸碱度pH5.56.0pH 计菌丝量8取一定重量发酵菌液，经转速 3500 r/min 离心 15min，称量离心沉
15、淀的菌丝体重量，计算菌丝体重量与菌液重量比值菌丝显微镜形态和杂菌鉴别可见灵芝菌种液体培养中特有的菌丝形态，大量菌丝分支，菌丝粗壮，有明显的锁状联合，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深。无杂菌显微镜（低倍镜、高倍镜、油镜）杂菌、害虫检测灵芝菌丝生长，划痕处无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长取样接种到营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、划线培养，分别在 28 和 37 恒温培养 2 d5d，每天观察菌落生长情况，参照 NY/T 1284DB61/T 1472.320219DD附录D（规范性）检验培养基配方D.1平板杂菌检验培养基牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，蛋白胨 10 g，琼脂 20 g，水 1000 mL。D.2营养肉汤培养基牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，蛋白胨 10 g，水 1000 mL，pH7.37.6（灭菌前）。_
