1、lSN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN /T 1005 - 2001 出口肉品中富拉磷残留量检验方法杯碟法Method for the determination of fravophospholipol residues in meat for export-Cylinder plate method 2001-12 -30发布2002 - 06 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN /T 1005-2001 前本标准是按照GB/T1.1-1993(标准化工作导则第1单元:标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定及SN/T0005-1996(出口商品中农
2、药、兽药残留量及生物毒素生物学检验方法标准编写的基本规定的要求而编写的。其中测定方法是采用日本厚生省畜水产食品中的残留物质检验方法和美国AOAC(公定分析方法中相应的分析方法。但在技术内容上稍有改变，经验证后按规定格式要求进行编写。在标准中同时制定了抽样和制样方法。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人:赵晖、黄洋、张宗显、徐新生。本标准首次发布。1 范围中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口肉晶中富拉磷残留量检验方法杯碟法Method for the determination of f
3、ravophosphoiipol residues in meat for export一-CyJinderplate method 本标准规定了出口肉品中富拉磷残留量检验的抽样、制样和杯碟测定法。本标准适用于出口分割猪肉中富拉磷残留量检验，其他肉品可参照使用。2 抽样和制样2. 1 检验批以不超过2500件为一检验批。SN /T 1005 - 2001 同一检验批的商品应具有相同的特征。如包装、标记、产地规格和等级等。2, 2 抽样数量批量，件最低抽样数，件125 1 26100 5 101 250 10 251 500 15 5011 000 17 1 0012 500 20 2. 3 抽
4、样方法按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于2 kg。放入清洁容器内，加封，标明标记，及时送交实验室。如每件中无小包装或有小包装但每袋质量超过2kg者，则可用灭菌刀具在抽出的包件中，每件取不少于100g，混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。1昆合后原始样的总量不少于2峙，加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4 试样制备将代表性样品中的可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g，作为试样，装入清洁容器内，加封后，标明标记。2. 5 试样保存将试样于一18C以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或
5、发生残留物含量的变化。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-12-30批准2002 - 06 -01实施SN /T 1005 - 2001 3 测定方法3. 1 方法提要用50%甲醇洛液抽提试样中的富拉磷，均质后，用氢氧化铀溶液调至pH8.0，回流煮沸15min，冷却后离心，取上清液进行杯碟法测定。样液中的残留富拉磷与蜡样芽胞杆菌作用，产生抑菌圈，从抑菌圈的大小用标准曲线法定量地测定富拉磷的含量。3.2 试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，水为蒸馆水。3- 2. 1 富拉磷标准品:904g/mg，由日本农林水产省东京肥饲料检查所提供。3.2.2 甲醇。3- 2. 3 氢氧化纳溶液
6、:质量分数为40%。3- 2.4 生理盐水:称取8.5g氯化饷，溶解于1000 mL水中，121C高压灭菌15mn。3- 2. 5 缓冲液1(pH7. 0):称取6.4g无水磷酸二氢饵，18.9gi元水磷酸氢二铀榕于水中，定容至1 000 mL , 121 C高压灭菌15mino 3- 2. 6 试验菌种:蜡样芽胞杆菌(Bacilluse时us)!由中国药品生物制品检定所提供，菌株号码14579。3- 2. 7 富拉磷标准储备液:准确称取适量的富拉磷标准品，先用少量甲醇溶解，再加甲醇悔液甲醇:水(体积分数)=1:汀，配制成富拉磷浓度为1000g/mL/的标准储备液，置4C冰箱中保存，可使用一个
7、月。3- 2. 8 富拉磷标准工作液:取一定量富拉磷标准储备液，用缓冲液1(3.2.5)稀释成浓度为0.094，0.188，0.375，0.75，1.5问/mL的标准工作液，须当天配制和使用。i3- 2. 9 培养基1:见附录A中AL3- 2. 10 培养基1I:见附录A中A203- 3 仪器和设备3- J 1 培养皿:内径90mm，底部平整光滑，具陶瓦盖。3. J 2 牛津杯:不锈钢管，外径(8.0:1: o. 1) m町，内径(6.0士0.1)mm，高度(10.0 :l: 0. 1) mm。3. 3. 3 游标卡尺:测量范围0150mm，精度0.02mm。3. 3. 4 均质器:转速不低于
8、10000 r/min。3. 3. 5 离心机:转速不低于4000 r/mi口。3. 3. 6 恒温培养箱:050C，搁板应保持水平。3. 3. 7 高压灭菌器。3. 3. 8 恒温水浴锅。/3. 3. 9 绞碎机。3. 3. 10 其他:回流冷凝管，蒸锢瓶，克氏瓶，离JU管及其他实验室常用玻璃器皿。3. 4 测定步骤3. 4.1 样?夜的制备称取10.0g试样于均质杯内，加入90mL50%甲醇，10000r/min均质2mi口，转入蒸馆瓶中，用氢氧化铀榕液调至pH8.0，90C回流煮沸15min，冷却后移入离心管中，以3000 r/mi口离心20min，取上清液作为试验样液。3. 4. 2
9、芽胞悬液的制备将试验菌种(3.2.的接种于营养肉汤培养基试管内，经(28土1)C培养(18土1)h，取1mL菌液，加入盛有适量培养基I的克氏瓶中，涂抹均匀。置培养箱(28:1:1 ) C培养一周。镜检芽胞数达85%以土，用适量灭菌生理盐水洗下菌台，于65C恒温水浴中加热30min，再以3000 r/min离心10min，弃去上清液，如此重复洗涤23次，再于65C水浴中加热30mn，最终用适量灭菌生理盐水稀释，制成芽胞悬2 液，置4C冰箱可保存数月。3. 4.3 芽胞悬液用量的确定SN /T 1005 - 2001 在实际测定前把不同量的芽胞悬液加到培养基E中，制成平板，培养(18土1)h，测定
10、能使0.094g/mL标准工作液产生直径二三10mm，清晰、完整的抑菌圈的最佳芽胞悬液用量。3. 4. 4 检定用平板的制备将培养基E熔化后，冷却至45C500C，加入适量芽胞悬液(从3.4.3测得)，混匀，取8mL注入培养皿，使培养基均匀覆盖其底面，保持水平，待其凝固。所用平板须当天制备。3. 4.5 标准曲线的制备用富拉磷标准工作液(3.2.8)制备标准曲线，以0.375问/mL浓度的标准工作液为参考浓度。每个标准工作液浓度取三个检定平板为一组，每个平板上置6个牛津杯，使牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60。角间距，其中3个间隔位的牛津杯中加0.375g/mL参考浓庭标准工作液，另3个间隔
11、位的牛津杯加其他浓度的一种标准工作l液。4个浓度标准工作液共12兮检定平板，用于制备标准曲线。O. 375g/mL参考浓度的标准工作液将得到36个数值，而其他标准王作液分别得到9个数值。将陶瓦盖盖好，置(28=:i=1) C培养(18=:i=1)h。培养后，取出平板二除去牛津杯，精确测量各个浓度的/ 抑菌圈直径(精确到0.1mm)，分别求出每组3个平板上参考浓度的抑菌圈直径读数和其他浓度的抑菌圈直径读数的平均值。再求出0.375吨/mL参考浓度36个拥菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为每组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(
12、2)算出L和H点的直径，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)，富拉磷标准工作液浓度(g/mL)为横坐标(对数级)，通过L和H点连一直线即为标准曲线。L = (3+ 2b + c -:- e)/5 ( 1 ) H = (3e + 2d十c一/5(2 ) 式中:L一标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，mm;H一标准曲线上最高浓度拥菌圈的直径，mm;c一一参考浓度O.375月/ffiL的36个抑菌圈直径的平均值，mm;a ,b,d ,e 分别表示标准曲线中其他标准浓度(0.094，0.188，0.75 , L , 5月/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。3. 4. 6 祥液的
13、测定每份样液取3个检定平板，在每个平板上放6个已灭菌的牛津杯飞按制备标准曲线方法放置)，在相间隔3只牛津杯里注满试验样液，在剩余的3只牛津杯里分别注J满富拉磷标准参考浓度工作液(0.375g/mL)。将陶瓦盖盖好，于(28士l)C下培养(18士1)h，然后取出平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，准确测量抑菌圈直径(精确到0.1mm)二3. 5 结果的计算和表述如样液抑菌圈直径Il;ltion. Place the clay covers on the plates and incubate at (28 :t 1)C for (18土1)h. Take the plates out, remov
14、e the cylinders , mea sure diameters of inhibition zone as accurately as possible. 3.5 Calculation and expression of the results If the value of the inhibition zone is less than 10 mm , repo时residues，of fravophospholipol in sam-ple as Negative . If the diameters of inhibition zones is ;: 10 mm , ave
15、rage the readings of sample solution and refer ence working solution on the thre,e plates ,correct the average valu of sample solution. Obtain the correspondingconcentration value from the standard curve-/Then calculate the content of fravophospholipol residues in test smp!l by eqation (3): X = c/m
16、. ( 3 ) where X-the content of fravophospholipol residues in test sample , mg/kg; C一thefravophospholipol concentration of sample solution obtained from the standard curve , g/mL; m-the corresponding mass of test sample in each mL of final sample solution , g. Note: If the result of determination is
17、positive , i. e. the average zone diameter 10 mm , confirmation test (TCL method can be used to) may be carried out if necessary , to confirm the inhibiting substance is actually fravophospholipol. 11 SN/T 1005-2001 4 Limit of determination and recove叩4.1 Li mit of determination The limit of determi
18、nation of this method is 0.94 mg/kg. 4.2 Recovery According to the experimental data , the fortifying concentrations of fravophospholipol and their corresponding recoveries are: 0.94g/g， the recovery is 93.9%; 3.75g/ 9 , the recove叩is83.2%; 7.5g/g， the recovery is 92.8%. 12 SN/T 1005-2001 Annex A (S
19、tandard Annex) Media A1 Medium 1 (medium for stock and enrichment) Peptone Beef extract Sodium chloride Agar Distilled water 10.0 9 5.0 9 2.5 9 15 9 1 000 mL Dissolve the ingredients in distilled water with heating and stirring , adjust the pH 50 that the value after autoclaving is 6.5土0.1.Dispensei
20、nto Roux bottle, autoclave at 1210C for 15 min. A2 Medium 1I (medium for base and strain) Peptone Sodium chloride Yeast extract Agar Distilled water 3.75 9 1.25 9 1.25 9 15 9 1 000 mL Dissolve the ingredients in distilled water with heating and stirring , adjust the pH 80 t.hat the value after autoc
21、laving is 7.3:t0圃1.Dispenseinto conical flasks , autoclave at 121(; for 15 min. 13 CON-uccfHZ忧中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口肉品中富拉磷残留量检验方法杯蝶法SN/T 1005-2001 当今中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷4姥印张1.l0字数26千字2002年5月第一次印刷开本880X12301/16 2002年5月第一版印数1-2000 7G 定价12.00 奇峰书号:155066. 2-14408 网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1005-2001
