1、中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验Mlcroblologlcal examination of food hygiene Exam Ina ti。nof dlarrheogenlc EscM，如hiacoli 1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大炀埃希氏菌的检验。2 引用标准GB 4789. 28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料3. 1 天平s称取检样用。3.2均质器或乳钵。3.3 温籍：36士1，423. 4 水浴100，6568，50。3. 5 显微镜。3.6离心机。3. 7
2、 酶标仪。3.8细菌浓度比浊管：MacFarland3号3. 9灭菌广口瓶：500mL 3. 10灭菌三角烧瓶：500mL,250 mL0 3 11 灭菌平皿，gommX 15 mm. 3. 12灭菌试管：10mm 75 mm. 3. 13灭菌吸管：lmL,5mL。3. 14橡皮乳头。3. 15载玻片。3. 16酒精灯。3. 17灭菌金属匙或玻璃棒3. 18接种棒，镰锵丝。3. 19试管架，试管篓。3.20冰箱。3.21 注射器，0.25mL，连接内径为1mm塑料小管一段。3.22灭菌的刀子、剪子、慑子中华人民共和国卫生部1994-03-18批准GB 4 7 8 9. 6-9 4 代替GB47
3、89. 6 84 1994 09-01实施173 GB 4 7 8 9. 6-9 4 3.23 小白鼠：14日龄。3.24 硝酸纤维素滤膜150mm50mm，如.45 m。临用时切成两张，每张75mmX50 mm，用铅笔划格，每格6mmX6 mm，每行10格，分6行。灭菌备用。4 培养基和试J4. 1 乳糖胆盐发酵管z按GB4789. 28中4.9规定。4.2 营养肉汤z按GB4789. 28中4.8规定。4. 3肠道菌增菌肉汤s按GB4789. 28中4.18规定。4.4 麦康凯琼脂z按GB4789. 28中4.24规定。4. 5 伊红美蓝琼脂（EMB）：按GB4789. 28中4.25规定
4、。4. 6三糖铁琼脂（TS!)z按GB4789. 28中4.26,4.27规定。4. 7 克氏双糖铁琼脂（Kl）：按GB4789. 28中4.28 .4. 29规定。4. 8糖发酵管（乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇）：按GB4789. 28中3.2规定。4.9赖氨酸脱竣酶试验培养基按GB4789. 28中3.12规定。4. 10尿素琼脂（pH7.2）：按GB4789. 28中3.15规定。4. 11 氟化梆（KCN）培养基：按GB4789. 28中3.16规定。4. 12 蛋白陈水、肯定基质试弗Ll：按GB4789. 28中3.13规定。4. 13半固体琼脂z按GB4789. 28中4.30规定。
5、4. 14 Honda氏产毒肉汤：按GB4789. 28中4.34规定。4. 15 Elek氏培养基z按GB4789. 28中4.35规定。4. 16 氧化酶试剂按GB4789. 28中3.18规定。4. 17 革兰氏染色液按GB4789. 28中2.2规定。4. 18致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4. 19产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒。4. 20产肠毒素LT和ST大肠埃希菌标准菌株。4.21 抗LT抗毒素。4.22 多粘菌素B纸片，300IU .16 mmo 4. 23 0. 1 %硫柳录溶液
6、。4. 24 2%伊文恩蓝溶液。5检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序如下z174 6操作步骤6. 1 增菌测大腼菌群MPN 乳糖宜醇阳性的监酵曹GB 4 7 8 9. 6-9 4 检样25g曹肉汤225mL f音提严重的检悻匀液36士16h 主康凯肠道菌增菌肉汤EMB c 18 i 样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检验25 g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐I 75 GB 4789. 6-94 培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36土1培养6儿挑取1环，接种于
7、l管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42培养18h。6.2分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板g污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36士1培养1824h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。6. 3生化试验6. 3. 1 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（Kl)o同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱竣酶试验培养基。以上培养物均在36培养过夜。6. 3. 2 TS！斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，
8、KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TS！底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰民染色。6.4血清学试验6.4. 1 假定试验z挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价0血清和出血性大肠埃希氏菌0157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价0血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价。血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群见表1。如与某一个单价0血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。表1致泻大肠埃希氏菌所包括的0抗原群大肠埃希氏菌的种类EPEC EHEC
9、EJEC ETEC 所包括的O抗原群026 055 086 Olllab 0114 0119 0125ac 0127 0128ab 0142 0158 0157 028ac 029 0112c 0115 0124 0135 0136 0143 0144 0152 0164 0167 06 06 011 015 020 025 027 063 078 085 0114 0115 0126 0128ac 0148 0149 0159 0166 0167 6.4.2 证实试验制备O抗原悬液，稀释至与MacFarland 3号比浊管相当的浓度。原效价为1 160 I 320的0血清，用0.5%盐水稀释
10、至1 400稀释血清与抗原悬液在10mmX75 mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该0抗原。6.5肠毒素试验6.5. 1 酶联免疫吸附试验检测LT和STo6. s. 1. 1 产毒培养z将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于o.6 mLCAYE培养基内，37振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素BO.05 mL，于37lh，离心4000 r/min 15 min，分离上清液，加入0.1%硫柳录。.05 mL，于4保存待用。6. 5. 1. 2 LT检测方法（双抗体夹心法），（）包被g先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST
11、酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5 mL,i!ll匀后全部吸出于3.6 mL包被液中混匀，以每孔100 L量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4冰箱湿贪中过夜。（2）洗板s将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。（3）封闭：每孔加100L封闭液，于37水浴中1ho (4）洗板g用洗涤液E洗3次，操作同上。（5）加样本z每孔分别加各种试验菌株产毒培养液！OOL,37水浴中lh。（6）洗板g用洗涤液E洗3次，操作同上。（7）加176 GB 4789. 6-94 酶标抗体z先在酶标LT抗体管中加0.5 mL稀释液
12、，混匀后全部吸出于3.6 mL稀释液中混匀，每孔加100 L,37水浴中1h 0 (8）洗板g用洗涤液E洗3次，操作同上。（9）酶底物反应2每孔（包括第一孔）各加基质液100L，室温下避光作用510min，加入终止液50L。（10）结果判定：以酶标仪在波长492 nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。6. 5. 1. 3 ST检测方法（抗原竞争法），（1）包被g先在包被用ST抗原管中加0.5 ml.包被液，混匀后全部吸出于1.6 mL包被液中混匀，以每孔50L加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第
13、一孔留空作对照，置4冰箱湿盒中过夜。（2）洗板s用洗涤液I洗3次，操作同上。(3）封闭z每孔加100L封闭液，37水浴ho(4）洗板z用洗涤液E洗3次，操作同上。（5）加佯本及ST单克隆抗体z每孔分别加各试验菌株产毒培养液50L，稀释的ST单克隆抗体50L（先在ST单克隆抗体管中加O.5 mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6 mL稀释液中，混匀备用），37水浴1h0 (6）洗板z用洗涤液E洗3次，操作同上。（7）加酶标记兔抗鼠lg复合物先在酶标记兔抗鼠lg复合物管中加o. 5 mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6 mL稀释液中混匀，每孔加100I.,37水浴1h。（8）：板E用洗涤液E洗3次，操作
14、同上。（9）酶底物反应s每孔（包括第孔）各加基质液100L，室温下避光510 min，再加入终止液50L。（10）结果判定z以酶标仪在波长492nm下测定吸光度（OD）值2因企H.盟OD值一待测样本OD值100%二三50%为阳性阴性对照OD值目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。6. 5. 2 双向琼脂扩散试验检测LT，将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36经56h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30L，用已知产LT和不
15、产毒菌株作对照，于36经1520h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。6. 5. 3乳鼠罐胃试验检测ST将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36培养24h，以3000 r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热6030min，每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02 mL。将此滤液用塑料小管注入14日龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种34只，禁食34h后用三氯甲烧麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.070.09为可疑。6. 6结果报告综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。附加说明z本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由江西省卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人何晓育。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。177
