1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准G/T 5009.171-2003 保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定Determination of the action of superoxide dismutase in heaIth foods 2003-08-11发布2004-01-01实施410 中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员百前言本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位g吉林市卫生防疫站、吉林医学院。本标准第一法主要起草人s袁彦华、罗速、于敬伟、孙连军、赵凤明。本标准第二法主要起草人g罗速、袁彦华、张吉林、卢忠魁。GB/T 500
2、9. 171-2003 411 GB/T 5009. 171.一200351 吉同超氧化自由基0，可以造成机体细胞损伤。超氧化歧化酶(SOD)能够清除机体内Oi。食品中SOD活性的测定，国内外尚无标准检验法。因此，卫生部九五制标规划确定了食品中SOD活性测定的研究课题。本标准以修改的Marklund方法和化学发光法测定食品中SOD活性。前者SOD活性测定最低检出浓度为1.1711/mL，相当于1.1 X 10-8 mol/L.方法灵敏，仪器价廉，操作简单，易于推广;后者SODii性测定最低检出浓度为0.033U/mL，相当于3.0X 10-10 mol/L，灵敏度比前者提高约二个数量级。具有更
3、加灵敏、快速和干扰少等优点，但试剂较贵，可应用于仲裁或科研。两种测定方法对同一SOD酶测定结果元显著差异(P0.05)。412 1 范围保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定本标准规定了食品中超氧化物歧化酶(SOO)活性的测定方法。本标准适用于各类食品中超氧化物歧化酶(SOO)活性的测定。本方法第一法检出限1.17 U/mL，第二法检出限0.033U/rnL。第一法修改的Marklund方法2 定义25C时抑制邻苯三盼自氧化速率50%时所需的SOO量为一个活力单位。3 原理GB/T 5009. 171-2003 在碱性条件下，邻苯三盼会发生自氧化，可根据SOO抑制邻苯三酣自氧化能力测定S
4、OO活力。4 试剂4.1 A液，pH8.20 O. 1 mol/L三短甲基氨基甲烧CTris)盐酸缓冲溶液(内含1mmol!L EDTA 2Nal。称取1.211 4 g Tris和37.2mg EOTA. 2Na溶于62.4mL O. 1 mol!L盐酸溶液中，用蒸馆水定容至100 mL。4.2 B液，4.5mmol/L邻苯三盼盐酸溶液。称取邻苯三盼(A.Rl56. 7 mg榕于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100mL。4.3 10 mmol/L盐酸溶液。4.4 0.200 mg/mL超氧化歧化酶(SOO)。4.5 蒸馆水z二重石英蒸馆水。5 仪器5.1 紫外-可见分光光度计。5.2
5、 精密酸度计，精确度。.01pH。5.3 离心机。5.4 10mL比色管。5.5 10 mL离心管。5.6 玻璃乳钵。6 试样的制备6.1 固体样品(茶、花粉等)称取1.00 g样品置于玻璃乳钵中，加入9.0mL蒸馆水研磨5min，移人10 mL离心管。用少量蒸馆水冲洗乳钵，洗涤并人离心管中，加蒸馆水至刻度，经4000 r/min离心15 min，取上清液测定。6.2 澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品经4000 r! min离心15min，再取上清液测定。GB/T 5009.171-2003 7 分析步骤7.1 邻苯三酷自氧化速率测定在25C左右，于10mL比色管中依次加入A液2.3
6、5mL，蒸馆水2.00 mL，B液。15mLo加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1 min后吸光值，二者之差即邻苯三盼自氧化速率M.m(min-1)。本试验确定M325(min-1)为0.060。7.2 样液和SOD酶液抑制邻苯三盼自氧化速率测定按7.1步骤分别加入一定量样液或酶液使抑制邻苯三盼自氧化速率约为l/2午4325( min-1)，即A_32S(min-1)为0.0300SOD活性测定加样程序兑表1。试液A液/mL蒸锢水/mL样液或SOD液/LB液/mL自结果8.1 结果计算8. 1. 1 液体样品按式(1)计算:表1SOD活性测定加样表空白2.35
7、 2.00 。.15样液2.35 1. 80 20.0 0.15 . _ ,1 一1.325，-: u.n. 325 X 100 % SOD液2.35 1. 80 20.。口.15SOD活力(U/mL) 且几32-X4.5XXD.(1 ) 50% 式中2U/mLSOD酶活力单位;M325 -邻苯三盼自氧化速率$A_325一一样液或SOD酶液抑制邻苯三盼自氧化速率;v-一一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL)，D一酶液或样液的稀释倍数;4.5一一反应液总体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。8. 1. 2 固体样品按式(2)计算g.1 _ ,1 一一-一一325XI00%M骂骂D
8、 V , SOD活力(U/g)一一一阳X4. 5 X X-!. .( 2 ) . 50% V , V m 式中V 加入酶液或样液体积，单位为毫升(mL)，M 325 邻苯三酣自氧化速率;A325 样液或SOD酶液抑制邻苯三盼自氧化速率;D一一-酶液或样液的稀释倍数:V，-样液总体积，单位为毫升(mL)，m 样品质量，单位为克(g), 4.5 反应液总体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留三位有效数字。8.2 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。414 GB/T 5009. 171-2003 第二法化学发光法9 定义在分析条件下抑制50%发光强度时所需
9、的SOD量为一个活力单位。10 原理SOD能够催化下述反应2SOD 0，.-十0，.-+2日一-H，02+02在有氧条件下，黄瞟岭氧化酶可催化黄嗦岭(或次黄瞟岭)氧化转变成尿酸，在该反应过程中同时产生0，.-0 0; 可与鲁米诺(3氨基邻苯二甲酷脐)进一步作用，使发光剂鲁米诺被激发，而当其重新回到基态时.贝tl向外发光。由于SOD可消除O厂，所以能抑制鲁米诺的发光。通过该反应过程，以空白对照的发光强度值为100%，通过加入SOD后抑制发光的程度进行SOD活性的测定。11 试剂11. 1 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.2) 11. 1. 1 O. 1 mol/L碳酸销(N岛C)溶液
10、称取碳酸销(A.R)lO. 599 g用蒸馆水溶解并定容至1000mL。11. 1. 2 O. 1 mol/L碳酸氢销(NaHC03)溶液称取碳酸氢纳(A.R)8. 401 g用蒸馆水溶解并定容至1 000 mL。11. 1. 3 O. 1 mol/L碳酸纳碳酸氢锵缓冲液(pH10.2) 将O.1 mol/L碳酸销(Na2C03)溶液和0.1 mol/L碳酸氢销(NaHC03)溶液按6十4比例混合。11. 1. 4 O. 05 mol/L碳酸销碳酸氢销缓冲液(pH10.2) O. 1 mol/L pH 10.2碳酸锅碳酸氢纳缓冲液01.1.3)与蒸馆水按l十l比例混合。11. 2 O. 05
11、mol/L碳酸销碳酸氢销(内含O.1 mmol/L EDT A 2Na)缓冲液(pH10.2)称取37.2mg EDTA.2Na用0.05mol/L碳酸锅-碳酸氢销pH10.2缓冲液01.1.4)溶解并定容至1000 mL。11. 3 O. 1 mmol/L鲁米诺溶液(Luminol)称取3.54mg鲁米诺用蒸馆水溶解并定容至200mLo 11. 4 O. 1 mmol/L次黄瞟岭溶液(HX)称取2.76mg HX用蒸馆水溶解并定容至200mL 11.5 0.1 mmol/L黄瞟岭氧化酶(xmO. 1 mg XO用含O.1 mmol/L EDT A 2Na的0.05mol/L 碳酸盐缓冲液01
12、.2)定容至1.0 mL。11. 6 0.001 mg/mL超氧化物歧化酶(SOO)精密称取0.1mgSOD用含0.1mmol/L EDTA 2Na 的0.05mol/L碳酸盐缓冲液01.2)定容至100mL。11. 7 HX-L液O. 1 mmol/LHX溶液与0.1mmol/L鲁米诺溶液1+1(V/V)混合(临用时混合。12 仪器生物化学发光仪。13 试样的和j备按第一法中第6章规定的方法操作。只是固体样品用。.05mol/L碳酸纳-碳酸氢纳(内含0.1 mmol/L EDTA. 2Na)缓冲液01.2)代替蒸馆水。14 分析步骤14.1 绘制抑制发光曲线操作程序见表2和图10415 GB
13、/T 5009. 171-2003 40 000 086 这份制制疆军20 4 6 8 10 SOD/(ng/mL) 固1SOD抑制化学发光曲线表2SOD抑制化学发光曲线制作步骤O(对照)1 2 3 4 5 0.05 mol/L碳酸销碳酸氢锅缓冲掖(pHl0.2)/L10 O. 1 mg/mL XO/L 10 10 10 10 10 10 HX-L液/L980 980 980 980 980 980 不同浓度SOD(或试液)/L10 10 10 10 10 SOD浓度!.(ng/mL)或(样液体积/L)2 4 6 8 10 相对光强未抑制/%抑制/%14.2 测定SOD活性测定样品相对发光强度
14、，计算抑制发光率，并查SOD抑制发光曲线，得SOD量(ng)。15 结果15.1 结果计算15. 1. 1 液体样品按式(1)计算:, X 10-6X 3. 5 X 3300 SOD活力(U/mU= 一一一XD .( 1 ) VXcso 式中zm，一一查抑制曲线中SOD量，单位为纳克(ng), V 取样液体积.单位为毫升(mL)，3.5 标准SOD抑制50%发光时的SOD浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL), 3300-S0D标准比活力U/mg蛋白:c SOD酶液抑制50%化学发光率时的SOD浓度，单位为纳克每毫升(ng/mU，D一样液的稀释倍数。计算结果保留三位有效数字。15. 1. 2 固
15、体样品按式(2)计算:m, X 10-6 X V X 3. 5 X 3 300 SOD活力W/g)=一一一一一一一一一一一X D .( 2 ) mXV, Xc 式中z叫一一查抑制l曲线中SOD量，单位为纳克(ng)，m 样品质量，单位为克(g), V 样液总体积，单位为毫升(mLl;416 GB/T 5009. 171-2003 V , 取样液体积，单位为毫升(mL);3.5 标准soo抑制50%发光时的soo浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); 3300-S00标准比活力U/mg蛋白;c，-SOO酶被抑制50%化学发光率时的SOO浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL); D 样液的稀释倍数。计算结果保留三位有效数字。15.2 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。417
