1、ICS 65. 020. 20 B 21 GE3 中华人民共和国国家标准GB/ T 2930. 1 - 2930. 11- 2001 牧草种子检验规程Rules for forage seed testing 2001- 03 -14发布2001- 06 -01实施国家质量技术监督局发布GB/T 2930. 7-2001 前本标准是根据国际种子检验协会(lSTA)(国际种子检验规程)0999年版)制定的。本标准在植物种及其检验方法等主要技术内容上，等效采用了国际规程OSTA，1999)的第八部分:种及品种鉴定。另外，又纳入了国际规程未列入、但在我国具有重要经济价值且有适宜检验方法的29个植物种
2、，旨在使标准既具有国际标准的先进性和科学性，又可满足我国种子检验工作的实际需要。本标准是GB/T2930. 1 2930. 11一2001牧草种子检验规程系列标准之一。该系列标准对GB 2930-1982(牧草种子检验规程进行修订。修iJ后的标准由以下部分组成:GB/T 2930.1二2001牧草种子检验规程抨样GB/ T 2930.2一2001牧草种子检验规程净度分析GB/ T 2930. 3- 2001 牧草种子检验规程其他植物种子数测定GB/ T 2930.4-2001 牧草种子检验规程发芽试验GB/ T 2930. 5- 2001 牧草种子检验规程生活力的生物化学(四瞠测定GB/ T
3、2930. 6-2001 牧草种子检验规程健康测定GB/T 2930. 7-2001 牧草种子检验规程种及品种鉴定GB/T 2930. 8-2001 牧草种子检验规程水分测定GB/T 2930. 9- 2001 牧草种子检验规程重量测定GB/T 2930. 10- 2001 牧草种子检验规程包衣种子测定GB/T 2930. 11- 2001 牧草种子检验规程检验报告修订后的标准在编写格式上，与国际规程有一定区别。国际规程将所有附件均置于全部检验项目的正文之后，而且规程的大部分内容在附件之中，使用时需前后相互参照，颇为不便。而本标准在编排上，将各项目均作为独立的标准编写，将主要内容编在正文之中，
4、并将相关的附录紧继各标准的正文之后。68 本标准的附录A、附录B都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位:农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心(兰州)。本标准主要起草人:王彦荣;参加起草人员:孙建华、余玲、王赞文、卫东、李春杰。GB/T 2930. 7- 2001 ISTA前言农业上最大的风险之一是所播品种的种子不能表现其生产能力。种子检验便是为了在播种前评定种子的质量，使这种风险降到最低程度。种子质量是由不同特性综合而成的概念。这些特性对种子产业的不同部门一一生产者、加工者、储藏者、经营者、农民、认证机构以及负责种子管理的政府机构或部门等极为重要。在所有情
5、况下，检验的最终目的是测定种子的种用价值。种子是有生命的产品，其状况不像检验元生命或非生物产品那样能准确地予以预测。所采用的方法必须基于种子科学知识和种子检验工作者经验积累，所要求的准确性和重演性则因检验的目的而定。本规程规定的标准定义和方法可用于国际贸易间的种子质量评定，为此目的，检验方法的高度准确性和重演性是必须的。当种子交易超越国界时，有可能在不同国家的检验室检验。因此，所有检验室采用一致的标准方法非常重要，这样可在允许范围内获得一致的检验结果。本规程分为两部分-一规程正文和附件。规程正文部分阐述了各项目测定的目的和原则、采用的定义、以及概述了所用的方法和程序。附件部分对定义加以引申，并
6、详述了规程中所规定的程序和方法。如按照本规程检验的结果，需填报协会的国际种子检验证书，那就必须严格地遵守规程，对规程每项条文的解释应与该章附件中的有关细节相符。建议一个国家在管理国内种子贸易和实施国家种子质量管理法规时，应尽可能采用本规程及其附件。虽然此种情况并不必采用国际种子检验证书，但应认识到，如果与这个为国际范围所接受的规程和附件条文不符，将会阻碍各国间的种子自由流通。咨询检验Cadvisorytests)是一种根据送验者要求、为特殊目的而进行种子批评价的检验。这种检验需考虑诸如播种的季节、土壤类型和海拔高度等因素。对于这种检验，本规程和附件仅提供一个基本的指导，有关文献的其他技术可作为
7、补充方法。本规程和附件是为世界主要作物制定的。尽管不是每个细节，但是原则上也适用于本规程未提及的其他作物种类。另外，为提供足够的指导，有必要提到专门制造商的仪器设备，但这并不意味着ISTA认为此类仪器设备最好，而排除其他制造商的同类产品。69 1 范围中华人民共和国国家标准牧草种子检验规程种及晶种鉴定Rules for forage seed testing Verification of species and cultivar 本标准规定了种及品种的鉴定方法GB/ T 2930.7- 2001 本标准适用于牧草种子、草坪草种子和饲料作物种子质量检验的种及品种鉴定。2 引用标准下列标准所包含
8、的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/ T 2930. 1-2001 牧草种子检验规程杆样GB/T 2930. 4-=- 2001 牧草种子检验规程发芽试验GB/ T 8170- 1987 数值修约规则3 检验目的种及品种的鉴定目的是测定送验样品或送验样品所代表种批与所提及的种或品种的符合程度。4 定义本标准采用下列定义。4. 1 种子真实性genuineness of seed 供检种及品种与文件记录(如标签等)是否相符。4.2 品种纯度variety purity 品种在
9、特征特性方面典型一致的程度。用本品种的种子数占供检本植物样品种子数的百分率表示。4.3 变异株off-type 一个或多个性状(特征特性)与原品种育成者所描述的性状明显不同的植株。5 原则只有当样品的送验者对报检种或品种已有说明，并且具有一个可供比较的可靠标准样品时，鉴定才有效。供比较的性状包括形态、生理、细胞或化学等方面。进行种或品种鉴定时，可用种子、幼苗或在实验室、温室、培养室或田间小区中长成的较成熟植株。通常把种子和标准样品的种子进行比较，将幼苗和植株与同期邻近种植在相同的环境条件下处于同一发育阶段的标准样品的幼苗和植株进行比较。在特殊情况下，如果测定的结果确实可信(如测定染色体倍数)，
10、不一定要和标准的对照样品作比较。国家质量技术监督局2001-03-14批准2001 - 06 -01实施70 G/T 2930.7一2001当种或品种的一个或几个鉴别性状相当一致时例如自花授粉的种)，就可对异种或异品种的种子、幼苗或植株进行计数。当种或品种不够一致时如异花授粉的种)，则对明显的变异株进行计数，并对供检样品的真实性作出总体判断。6 器具及试剂6.1 器具检验所用仪器设备随方法的差异而不同。6.1. 1 实验室=适当地配备仪器、器具及试剂，以供形态、生理及细胞学的检查、化学测定及种子发芽之用。6.1. 2 温室和培养箱z需配备能调节环境条件的设备，以诱导幼苗或植株鉴别性状的发育。6
11、.1 . 3 田间小区:需具有能使鉴别性状正常发育的气候、土壤及栽培条件，并对防治病虫害有充分的保护措施。6.2 试剂腆、腆化钢、盐酸、氯化锅、苯酣、氢氧化镀。聚丙烯酷胶凝胶电泳法所需仪器及试剂参见附录A及附录B(标准的附录)。7 检验程序7.1 送验样品的重量送验样品的最低重量应符合表l的规定。表1种及栽培品种鉴定的送验样品最低重量种类限于实验室测定田间小区及实验室测Ig g 豌豆属CPis臼m)、野豌豆腐CVicia)、羽扇豆属CLuinus)及种子大小类1 000 2 000 似的其他属大麦属CHordeum)、燕麦属CAvena)、黑麦属CSeca!.e)及种子大小类似的其他属500
12、1 000 甜莱属(Beta)及种子大小类似的其他属250 500 所有其他属100 250 7.2 种子鉴定7.2. 1 试验样品按GB/T2930. 1-2001中7.2的规定分取试验样品，随机从试验样品中数取至少400粒种子，检验时须设重复，每个重复不超过100粒种子。如采用电泳法，试验样品的量可适当减少见附录A(标准的附录汀。7. 2.2 鉴定7. 2.2. 1 形态鉴定根据种子形态特征鉴定种及品种时，如有必要，可借助放大镜进行观察;测定种子色泽时，可在自然光或特定光谱(如波长为360nm的紫外灯下观察。大麦属最有效的鉴定特征是籽粒形状、外秤基部、籽粒颜色、腹沟基刺、腹沟宽度、小穗轴茸
13、毛多少、侧背脉纹齿状突起、内外秤榴皱、鳞被形状及茸毛稀密等。燕麦属的籽粒颜色是有效特征，可分为白色、灰黄色、黑色等。燕麦属和大麦籽粒颜色可在紫外光下加以区别，如白色燕麦种子显现荧光，黄色燕麦种子不显现荧71 GB/ T 2930. 7- 2001 光。豌豆属和羽扇豆属植物种在种子颜色、大小和形状上存在着可供鉴别的差异，可在日光或紫外光下直接用肉眼进行观察。7.2.2. 2 化学测定化学测定通常是借助某种特别的化学试剂与种子特有成分反应来鉴定品种。7.2.2.2. 1 羽扇豆属植物碱测定羽扇豆属种子中是否含有生物碱是一种种间鉴别特征。先将种子放入水中浸泡24h.然后将每粒种子切一薄片置于玻璃板上
14、，衬以白色背景，加1-2滴Lugol溶液卢戈氏液:将0.39g腆(1)和0.6g 腆化梆(Kl)溶于100mL水中J.若切片产生棕红色沉淀，即表明含生物碱。记录含或不含生物碱种子数。7.2. 2.2.2 燕麦盐酸(HCl)测定当对燕麦种子荧光测定有怀疑时，特别是对经处理或恶劣气候条件下收获的种子，则可用盐酸溶液测定。将种子浸入盐酸溶液(1份38%盐酸溶液和4份蒸馆水配制而成中6h，捞出种子置于滤纸上，使其自然风干1h，根据棕褐色或黄色进行鉴定。J. 2. 2. 2. 3 燕麦(A.sativa)、大麦(H.vuLgare)、黑麦草(L.perenne)和普通早熟禾(Poa户ratensis)等
15、种子的苯酣测定根据种子内外秤染色鉴定大麦、燕麦和黑麦草种子。采用纸上法，于250C下预湿18-24h。将种子移入经1.0%苯酣溶液(5g结晶石碳酸加入500mL 蒸锢水)湿润的滤纸上，室温下进行处理，燕麦2h，大麦4h.黑麦草和普通早熟禾24h.检查和记录颜色反应，与标准样品进行比较。通常颜色分为不着色、浅褐色、褐色、深褐色、黑褐色和黑色。7.2.3 鉴定豌豆和黑麦草品种的聚丙烯酷胶凝肢电泳(PAGE)的标准参照方法见附录A(标准的附录)。J. 2. 4 鉴定燕麦品种的聚丙烯酷胶凝胶电泳(PAGE)的标准参照方法见附录BC标准的附录。7. 3 幼苗鉴定7. 3. 1 试验样品按GB/T2930
16、. 1-2001中7.2规定分取试验样品，从试验样品中随机数取至少400粒种子.4次重复，每个重复100粒种子，如作染色体倍数的初始测定，可用100粒;当初始鉴定不能得出结论时，须再取100粒种子进行鉴定。7. 3. 2 鉴定将种子置于适宜发芽床上萌发，当幼苗达到适当的生长阶段时，对全部或部分幼苗进行鉴定，有的需进一步处理，有的可直接鉴定。在测定染色体倍数时，切开根尖或其他细胞在显微镜下进行鉴定。7. 3. 2. 1 禾谷类有些品种可根据其芽黯颜色分类。将种子放在垫有潮湿滤纸的培养皿里萌发，当幼苗发育达到适当阶段时，鉴定芽鞠的颜色，其变异范围可以从绿色到紫色。可用1%氯化销或盐酸溶液湿润滤纸使
17、其加深颜色，或在鉴定前用紫外光照射幼苗1-2h。7.3. 2.2 黑麦草属(Lolium)大部分多花黑麦草(L.multi!Zorum)品种的大多数幼苗根迹在紫外光下显现荧光，而大部分多年生黑麦草(L.perenne)品种的大多数幼苗根迹不显现荧光。为了测定幼苗根迹对紫外光的反应，可将种子放在合造的无荧光的白色湿润滤纸上，在20/30C变温或20C恒温、黑暗或弱光(不超过2501x)条件下萌发，种子分开排列，以防止根相互缠绕使显现荧光的根迹混淆不清。休眠种子可采用预先冷冻(见GB/T2930.4-2001中表1的规定)方法进行处理。当根系发育到足够程度(幼苗根迹产生的荧光都能被检查出来)时即可
18、在紫外光灯下进行鉴定。为了看清伸人纸层内的根有无荧光，须将不显现荧光的幼苗从滤纸上取出。记载每重复显现荧光及无荧光的幼苗72 GB/ T 2930. 7- 2001 数及正常幼苗数。其结果用整数填报。7. 3. 2. 3 羊茅属(Festuca)紫羊茅(F.rubra)和羊茅(F.ovina)可用与黑麦草属相同的方法进行鉴别。在含有氨的空气中，其根部本身会发出荧光。在紫外光照射下，紫羊茅根显现黄绿色的荧光，而羊茅根则显现蓝绿色荧光。种子可按7.3.2.2规定的黑麦草属方法进行发芽。当幼苗充分发育后，便可进行鉴定，鉴定前可用0.5%氢氧化镀(NH40H)(取1.67 mL浓NH40H，加入98.
19、33mL蒸锢水)喷施幼苗上，1min后注紫外灯下进行鉴定，记录每重复显现黄绿色或蓝绿色荧光的幼苗数。7.4 温室或培养室的植株鉴定7.4.1 试验样品所播种子量要充足以保证能长成100株植株，但攀缘的或匍甸的种数量可减少。种子按GB/ T 2930. 1-2001中7.2的规定取得。7. 4.2 鉴定种子播种于造宜的容器内，并保持在对鉴别性状发育所需要的环境条件，当植株达到适当的发育阶段时，观察记载每个植株的鉴定性状。7. 5 田间小区植株鉴定送验样品收到后，要尽快播种。每个样品至少播种两个重复小区。为避免失败，重复应适当布置在不同田块或同一田块不同位置。小区大小要能为准确鉴定提供足够的植株。
20、播种方式可采取条播，具有足够的行、株距离，以便所要鉴定的性状能充分发育。一般建议牧草行长约15m，行距为3045cm。为减少移栽和间苗可能引起的误差，应调整播量，使试验区和对照区植株数大约相等。必要时可采取间苗或补苗办法。当通过考查单株就能区别两个或更多的品种时，则应采用穴播。可在实验室或温室将种子分开播种，而获得单株。当植株己长到适当大小时，即移栽到田间小区。如条件适宜种子可直接播在小区，以后可通过间苗使其成单株状态。各植株的间距至少达60cm。同时应栽种标准样品的单株以作对比。株数多少取决于重复次数和所用的统计处理。不同品种植株需经过全生育期才能充分表现出差异，因此，鉴定工作应延续到整个生
21、育时期。但从开花(豆科牧草或抽穗(禾本科牧草)开始至生育终期是鉴定样品的最好时期。在此期间对植株需进行数次观察。凡可看出是属于另外品种或种的植株或者变异株均应计数和记载。如有可能最好在鉴定植株的同时，实际计算或估算小区内的植株数。8 结果计算和表示当鉴定的种子、幼苗或植株数不多于2000时，用所发现的变异数占供验样品数的整数百分率表示;如果多于2000，则百分率取一位小数。数值修约按GB/T8170的规定进行。在实验室、温室及培养室所测定的结果须注明受检种子数、幼苗数或植株数。8. 1 种子和幼苗计算鉴定种或品种的种子(幼苗、其他种或品种的种子(幼苗)占供试种子(幼苗)的百分率。8.2 田间小
22、区鉴定凡有可能，应分别计算所发现的其他种、品种或变异株数占鉴定株数的百分率。对窄行条播的牧草，当难以估计每小区中鉴定植株的总数时，其结果可用播种重量中所产生的变异株数表示。如果性状是经过测量的，还可算出平均数和其他统计数值。异花授粉的品种，通常植株性状的变异达到难以准确地确定各种异型植株的程度。此种情况下，在填写各种杂株百分率的计算结果中，应补充一些有关供检样品真实性状的适当评语。在特殊情况下，如果未设对照样品时，应该予以注明。73 GB/ T 2930. 7- 2001 附录A(标准的附录)鉴定豌豆和黑麦草晶种的黯丙烯酷肢凝股电泳(PAGE)的标准参照方法A1 原理由单粒豌豆种子或黑麦草种子
23、粗粉中提取的种子蛋白质，经用SDS(十二烧基硫酸锅处理后可在不连续的SDS聚丙烯自克服凝胶电泳过程中得到分离。胶片上的蛋白质谱带类型即能表现出品种特征。A2 器具及试剂A2.1 仪器设备a)任何适宜的垂直电泳设备(如PharmaciaGE2/ 4 Bio-radProtean); b)离心机、离心管;c)天平(0.001g); d)粉碎机或碾磨机;e)水浴锅;f)水泵式油泵、真空干燥器;g)不同规格的移液管、微量进样器、试剂瓶、烧杯、容量瓶、三角烧瓶、滴管、培养皿、注射器(25 mL)及针头等。A2. 2 试剂所有化学试剂都应是分析纯级或相当的等级。丙烯酷胶(经专门纯化后用于电泳); 亚甲基双
24、丙烯酷胶(经专门纯化后用于电泳)(BIS);三经甲基氨基甲皖(Tris); 甘氨酸;盐酸;十二炕基硫酸铀(SDS); 丙三醇;2-疏基乙醇;二甲基甲酷胶CDMF);过硫酸镀(APS)(或核黄素); NNNN-四甲基乙二胶(TEMED); 甲醇;冰乙酸;三氯乙酸(TCA); PAGE蓝G-90(或PAGE蓝83，或任何相当于考马斯亮蓝G或R系列染料的试剂); 澳盼蓝。A2.3溶液A2.3.1 主体分离胶缓冲溶液1 mol/L Tris-HCl.pH8. 8 :121. 1 g Tris溶解于约750mL蒸馆水中，滴加1moI/L的盐酸溶液调节pH值至8.8(1mol/L盐酸约为每升蒸馆水中含90
25、mL盐酸原液，滴加这种溶液约15mL)，然后定容至1L，存放于4.C下。74 GB/T 2930. 7- 2001 A2. 3. 2 浓缩胶缓冲溶液1 mol/ L Tris-HC1 , pH6. 8 : 30. 3 g Tris溶解于约200mL蒸锢水中，用盐酸溶液调节pH值至6.8(开始滴加盐酸原液约8mL，之后再用1mol/L盐酸溶液加调)，然后定容至250mL，存放于4C下。A2. 3. 3 SOS榕液10 g SOS溶于蒸馆水中(搭解时需加温和轻摇)，定容至100mL，此液可室温下存放，如果出现SOS析出，可稍加温使其重新溶解。A2. 3. 4 1%过硫酸镀溶液0. 1 g过硫酸镀溶
26、解于10mL蒸馆水中，此液必须在每次使用前新配。A2. 3. 5 样品提取缓冲原液在12.5mL浓缩胶缓冲原液(A.2. 3. 2)中加入20mL丙三醇，24.1mL蒸锢水，4g SOS和12mg 澳酣蓝(也可不加澳盼蓝)，混合均匀后室温存放，如出现SOS析出，可稍加温使其重新溶解。A2. 3. 6 凝胶固定液在400mL甲醇中加入冰乙酸100mL用蒸馆水定容至1L。每块胶片约需200mL 注:可用三氯乙酸取代冰乙酸，三氯乙酸的最终浓度控制在15%-20%之间(约2.3g)。A2. 3. 7 凝胶染色液15%三氯乙酸(TCA)(375 g TCA用水配榕至2.5L);l%PAGE蓝或同类试剂的
27、甲醇溶液C1g试剂溶于100mL甲醇中)号液200mL加号液10mL可染色一块胶片。A3 程序一般每个样品测定100粒种子，如要求更为精确地估测品种纯度，则需测定较多的种子样品。如果是仅同标准值比较，后续测定则可只测定50粒种子，如果仅对种子批中某一主要成分的一致性作简单核准，则可测定少于50粒的种子。对于黑麦萃属，通常是分析较大量种子的群体样品，绝大多数情况下，仅用于测定种子批的一致性，而不允许用于检测两个或更多品种的棍合种子。A3. 1 样品提取A3. ,. , 豌豆用电动粉碎机(也可以采用研钵或类似设备)将单粒种子的子叶打碎成细粉。稀释的提取缓冲液可用下述方法配制:17份提取缓冲原液(见
28、A2.3. 5);3份琉基乙醇;40份蒸馆水。一般只配足当天所需用量。细粉与稀释的提取缓冲液以40mg: 1. 0 mL比例放入1.5 mL的聚乙烯离心管中提取，室温下放置约1h，用转动搅和器使细粉重新悬浮，并在沸水浴中加热10min(离心管盖时留一条小缝，以免管内压力升高)，冷却后于18000Xg条件下离心5min，取清澈的上清液用于电泳。A3. ,. 2 黑麦草用锤式碾磨机(也可以采用滚刀式咖啡粉碎机或其他搅拌式粉碎机)将O.52. 0 g种子碾磨成粗粉后用于分析。稀释的提取缓冲液可用下述方法配制:17份提取缓冲原液;6份就基乙醇;10份二甲基甲酷胶;17份蒸馆水。一般只配足当天所需用量。
29、种子粗粉与稀释提取缓冲液以80mg ;l. 0 mL进行提取。其后续处理方法完全与A3.1. 1相同。A 3. 2 凝胶制备根据电泳设备的结构和类型安装好清洁干净的胶模。如果电泳装置是采用粘贴式密封条，则以至少提前一天安装胶模为好，这样可使密封条粘贴得更充分更紧密。建议凝胶厚度以1.5 mm或更薄为好。下面介绍制备12.5%丙烯酷胶浓度的分离胶和5%浓缩胶方法。A3. 2. , 主体分离胶75 G/T 2930. 7-2001 如欲制备4块凝胶080mmX140 mmX 1. 5 mm)，需用下述数量的溶液:56.4 mL 1 mol/L Tris-HC1 pH 8. 8的缓冲榕液(见A2.3
30、. 1)。86.25 mL凝胶溶液(19.6g丙烯酷胶+0.26g BIS，用蒸馆水定容至90mL)。于抽气瓶中抽去洛液里的空气，然后加入3.75 mL 1 %APS CA2. 3. 4)、1.5 mL 10%SDS (见A2. 3. 3)和75mL TEMED(直接取用原液)，小心混匀(勿形成泡沫)后，凝胶缓慢倒入胶模，也可用25mL的注射器灌胶。胶液灌注至距顶部34cm处(这部分将用于灌放缩胶)。在主体分离胶上部注入lcm厚的蒸锢水(或异丙醇)，然后静置让其聚合(约1h)。注:如元条件抽气，则可略去这一步换用浓度高3倍的APS溶液即3.75mL3%的APS(0.3g APS溶解于10mL
31、蒸馆水中)J。A3. 2. 2 浓缩胶用吸管吸去分离胶表面的覆水(或异丙醇)，并用稀的浓缩胶缓冲液(将浓缩胶缓冲液与蒸馆水按1 : 8比例稀释)简单冲洗，小心倒去稀释液，再用滤纸吸干。欲制备4份浓缩胶需用下述数量的溶液:10 mL 1 mol/ L Tris-HCl pH6. 8的缓冲溶液(见A2.3. 2)。67.2 mL凝胶溶液(4.0g丙烯耻胶加0.07g BIS用蒸榴水定容至67.2mL)。放在抽气瓶中抽气。然后加入3.0mL l%APSC见A2.3.4)、0.8mL 10% SDS(见A2.3. 3)和80 mL TEMED(直接取用原液)。浓缩胶倒在胶模中的上部，插入用丙烯制成的梳
32、子，确保梳齿下方无气泡，然后静置让其聚合(约1h) 0同样，如果采用较高浓度的APS溶液3.0mL 2%的APS(O.2 g APS溶于10mL蒸馆水中门，则可省去抽气这一环节。对于浓缩胶的聚合反应，可以用0.008%核黄素熔液取代APS，胶液放在一般光线下会发生聚合，但欲使其聚合良好，需用紫外灯。确切的用量需经试验来决定，要求在3060min内完成聚合。建议50 mL浓缩胶温合液加7.5mL核黄素溶掖。A3.3 电泳电泳缓冲液(或叫电极缓冲液)的组成为:3. 0 g Tris; 14. 1 g甘氨酸;1. 0 g SDS o 用蒸馆水定容至1L(或许需要稍作加温以溶解SDS)，往电泳槽的上槽
33、和下槽中倒入足够量的电极缓冲液(新配制)。由浓缩胶上拔出梳子(此胶相当稀软)，形成的小槽冲洗后加入适量的电极缓冲液。用进样器将样品加入小槽(即样品槽)中，进样量的多少主要由凝胶厚度和样品槽大小来决定。大多数情况下515mL 较为适宜。如果需要，可加入5L1%的澳酣蓝水溶液(含10%的丙三醇)于各样品槽中作为指示剂也可预先混入提取缓冲原液(见A2.3. 5)中。如果胶模原先用粘条密封，此时可将下方(即底部)的粘条取掉。用电极缓冲液将样品槽充满(需小心，不要使样品液搅动)。凝胶放置于电泳槽中，开始每块胶先用25 mA的电流电泳，当前沿指示剂迁移出浓缩胶后，电流增加至45mA，直至澳酣蓝指示剂迁移到
34、凝胶底部。温度应保持在15200C范围，电极缓冲液可用自来水或冷却液进行循环冷却。A 3. 4 固定与染色有数种不同的方法可用来固定和染色蛋白质。如元需立即得出结果，在电泳结束后从胶模中取出凝胶放在固定液(见A2.3. 6)中，并缓缓摇动至少1h，再用蒸锢水漂洗5min，然后放于染色液(见A2. 3. 7)中至少2h (通常过夜)。将染色后的凝胶用蒸馆水漂洗23h(如果背景颜色较深，可加入TCA)，然后密封于聚乙烯袋中，供检查或拍照。如果密封得当，凝胶可于4C下保存若干个月。如需快速染色，凝胶可放在较高温度(80C)下固定和染色30min，然后冷却，再放入10%冰乙酸和35%乙醇的溶液中脱色3
35、060min，其间常加摇动。A4 结果鉴定通常采用比较方法，即比较样品的蛋白质谱带类型是否与标准对照品种的相一致。应在每块胶片上都配加一个已知样品作为对照，该对照品种应具有确定的蛋白质谱带及其详尽描述。如对照品种的谱带76 GB/T 2930. 7-2001 清晰可辨，可作为该胶片的定性标准，对该胶进行分析比较，鉴定种子真实性及品种纯度。此外，由于每块胶片中都有一己知分子重量的标准蛋白，不同的胶片可以借其得到校核，并计算出那些主要蛋白质谱带的分子重量。附录B(标准的附录鉴定燕麦晶种的聚丙烯酷肢凝胶电泳(PAGE)的标准参照方法B1 原理从种子中提出来的服蛋白或乙二醇溶蛋白(初级燕麦蛋白)可用p
36、H3.2的聚丙烯眈胶凝胶电泳CPAGE)进行分离，所产生的蛋白谱带可作为品种的指纹，这种指纹可用来鉴定未知品种，并通过分析单粒种子来测定品种的棍杂程度(即对品种进行鉴定)。一般推荐测定样品为100粒种子。如要求非常准确地测定品种纯度，则需较大样品数。如仅同标准值比较，或仅对种子批中某一主要组分的一致性作简单的核对，则可只测定50粒种子。B2 仪器设备及试剂B2.1 仪器设备采用的仪器设备与鉴定豌豆属相同见附录A(标准的附录)J。B2.2试剂所有化学试剂都应是分析纯级或更好等级。丙烯酌胶(经专门纯化后用于电泳); 亚甲基双丙烯酷胶(经专门纯化后用于电泳); 尿素;冰醋酸;甘氨酸;硫酸亚铁;抗坏血
37、酸;过氧化氢;焦宁GC或焦宁y);三氯乙酸;乙二醇;甲醇:考马斯亮蓝G250或ServaBlue GC或同类试剂)。B2.3 溶液B2.3. 提取液在乙二醇水榕液乙二醇与水的比例为75: 25(v/v)J中加入焦宁GC或焦宁Y)(O.05% W/V)和3 mol/L的尿素08%W/V).低温保存或新配。B2. 3. 2 电极缓冲溶液冰醋酸4mL.甘氨酸0.4g，加元离子水定容至1L，低温保存。B2. 3. 3 凝胶缓冲溶液冰醋酸20mL.甘氯酸1.0 g.加元离子水定容至1L低温保存。B2. 3. 4 固定及染色液77 GB/T 2930. 7- 2001 把考马斯亮蓝G250或ServaBl
38、ue G 19、同类试剂1g、甲醇250mL和三氯乙酸100g容于800mL无离子水中。B3 程序B3. 样品提取除去内、外秤，用于钳夹碎样品，或用研磨或电动搅碎机将样品打碎成细粉。细粉放入1.5mL的聚乙烯离心管中提取，加入提取液(见A.2. 3. 1) (0. 1 mL/粉碎种子)，将细粉和提取液充分混合，于室温下放置2h或一夜，于14OOOXg条件下离心15min，取清澈的上清液用于电泳。B3. 2 凝胶制备根据设备的结构和类型安装好清洁干净的胶膜。事先用硅处理玻璃板，可使电泳后的凝胶容易剥离。胶膜可以固定在塑料支架上，这样就可以在灌胶时保持住凝胶。制备两块凝胶(160mmX180 mm
39、X l. 5 mm)的办法如下:取凝胶缓冲液60mL，加人12.5g丙烯酷股，0.4g亚甲基双丙烯酷股，6g尿素，0.1g抗坏血酸，0.005g硫酸亚铁，摇匀后再用凝胶缓冲液定容至100mL，加入新配的0.6%(V /V)的过氧化氢溶液(每100mL凝胶溶液加0.2mL)，快速混匀后倒入肢膜。在加入过氧化氢溶液之前，凝胶可先冷却至冰点，聚合前在胶膜上方插入丙烯酸样品梳，以使在凝胶上部形成样品槽。凝胶混合液应充满胶膜，或在胶液上面加一层水以保证凝胶的上表面聚合良好。凝胶的聚合在5-10 min内完成。B3.3 电泳从已聚合凝胶上取出样品梳，在样品槽中注入电极缓冲液，再将适量的缓冲溶液(依所使用的
40、仪器而定注入电极。分别将18L样品提取液加入各样品槽中，胶膜放入电泳槽内，并保证样品槽中充满电极缓冲液。然后进行电泳，所需时间为:200V(稳压)10min ,500 V(稳压)20min，以使前沿指示剂焦宁G通过凝肢的2倍。用水循环流过缓冲液槽内的冷却管，以保持温度在15-200C。B3. 4 固定和染色从电泳槽中取出胶膜，拆开，然后将胶片放入已盛有200mL固定和染色液的塑料盒中。染色在1d 内即可完成。经适当染色后，取出胶膜在蒸馆水中漂洗2-3h，以便使染色部位清晰，然后进行拍照，凝胶片上各种蓝色背景可用10%三氯乙酸洗去。B4 燕麦醇溶蛋白谱带的定名和鉴定最好的方法是比较方法，即比较燕
41、麦的一个未知样品的蛋白质谱带的轮廓外形与提取的可靠的参照样品是否一致，同时加以分析。对于燕麦醇溶蛋白国际上没有统一的命名体制，而且燕麦的蛋白谱带是按顺序记数或者测定它们的相对迁移率。78 EON-F.ogNI二。何NH阁。中华人民共和国国家标准牧草种子检验规程GB/ T 2930.1-2930.11- 2001 等中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售当岳开本880X12301/16 印张6%字数210千字2001年8月第一版2001年8月第一次印刷印数1-1500 峰7G 定价50.00网址书号:155066 1-17711 晤576-543 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533科目GB/T 2930.1-2001 H
