1、中华人畏共和入境检验检疫行业标准SN/T 1616-2005 非讲171史事花叶病毒栓测方法Deection of African Cassava Mosaic Virus 2005心8斗8发布060608000117 2006-02-01实施中华人民共和国发布国家质量监督栓验检痊总局前言本标准的附录A和附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:相宁、李明福、魏梅生、张成良。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1616-2005 SN/T 1616-2005 非洲木薯花叶病毒检
2、测方法1 范围本标准规定了非洲木薯花叶病毒检测鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有非洲*薯花叶病毒的所有进境木薯、茵木等的检疫检测和鉴定。2 服理2. 1 非洲木薯花叶病毒学名:African cassava mosaic virus 缩写:ACMV分类地位:联体病毒科(Geminiviridae)，菜豆金黄色花叶病毒属(Begomovirus)。2.2 寄主范围自然寄主主要为木薯(Manihot esculenta) ，人工接种可侵染瓜类、烟类等多种植物。2.3 瘸嚣症状木薯植株各个不同生长时期都可以被侵染致病，幼龄植株更易感染，典型症状为系统花叶。感病植株首先在叶片上呈褪绿小斑.逐渐
3、扩大，褪绿斑愈合与正常绿色形成花叶。有时受侵叶背面可见突起。症状严重程度随季节、栽培品种不同而异。在潮氓、凉爽雨季症状表现得最严重，而夏季通常隐症或浅花叶。2.4 分布地区西非和南部非出。包括:肯尼亚、南非、安哥拉、刚果、喀麦隆、贝宁、启日利亚、中非、加纳、科特迪瓦、布基纳法索、卢旺达、坦桑尼亚、乌干达和塞内加尔等。2.5 传播方式木薯粉虱(Bemisiatabaci)为传毒介体，以持久方式传毒，并可以保持侵染能力9d，大约10%的传出单头成虫完成。病毒存在于口器中.脱皮仍保留病毒，但不能通过卵传给下一代。嫁接可以传晖，种子不传奇。汁液可以传毒，但传给木薯困难。该病毒通过染病种薯、块茎、组培茵
4、的运输等人为途径进行传播。2.6 粒体形态病毒粒体为双生球状(30nmX20 nm)，长轴中心线上有一明显的腰，每一面都有明显的五角形，偶尔可见五联体病毒。2. 7 基因组单链环状DNA，二分体，DNA寸长2.779kb , DNA之长2.724kb , 3 仪器设备、用具及试jflJ3.1 仪器设备透射式电子显微镜、酶联检测仪、电子天平0/1000 g)、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。3.2 用具可谓移液器(0L10L、20L100L、200L1 000L、1000L50 000L)、可调移植器头、酶联极、eppendorf管、指型管、研钵等。3. 3 试剂酶联检测试剂(见附录A)
5、和电镜观察样品前处理试剂。SN/T 1616-2005 4 实验室检验4.1 木薯的检验鉴定种子隔离温室中的待检样品长出苗后.取叶片做血清学鉴定(见附录A)，结果为阳性的再用生物学(见附录B)、电镜观察(参见附录。两种方法进行复查。4.2. 木薯试智商、脱毒茵的检剖鉴定直接对植株进行血清学检测，有阳性结果的，生物学测定和电镜观察两种方法进行复查。5 结果评定薯块和病株样品症状如与2.3描述的相同，从中发现的病毒粒体与2.6描述的相同，样品血清学检测为阳性，生物测定鉴别寄主反应与附录B描述相吻合，即可判断为非洲木薯花叶病毒。6 样品保存与复核6. 1 样品保存木薯病薯块、叶片样品妥善保存于40C
6、冰箱中，试管苗保存于组培室中.以备复核。6.2 结果记录与资料保存完整的实验记录要钮括:样品的来源、种类、时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学鉴定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片，血清学检测得有酶联板反应的照片。6.3 复核鉴于非洲木薯花叶病毒为一类检疫性有害生物，应做好以上准备，并在1周内接受复核。由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性.必要时进行复核实验。2 SN/T 1616-2005 附录A(规范性附录)正抗体夹心酶联免瘦服附实验A.1 试剂A. 1. 1 包被缓冲液(pH9.6
7、)联酸铀CNazC03) 嵌酸氢铀CNaHC03) 1. 59 g 2.93 g 叠氮化铀(NaN3)0.20 g ;容于900mL蒸馆水中，用盐酸调至pH9.6，再用蒸馆水补足1LA. 1. 2 PBS磷酸盐缓冲液CpH7.4)氧化铀(NaCD磷酸工氢押(KHzPO.)8 g 0.2 g 磷酸铀CNaZP04)1. 15 g 氧化饵(KCl)0.2 g 叠氮化铀(NaN3)0.20 g 溶于900mL蒸锢水中，用氮氧化铀谓至pH7.4，再用蒸锚水补足1LA. 1.3 洗涤缓冲液(PBST)PBS 1 L 吐温200.5 mL A. 1.4 样品抽提缓冲液0.05 mollL Tris缓冲液(
8、含0.06mol/L亚硫酸铀，pH8.5)A. 1.5 结合缓冲液PBST十2%PVP十0.2%牛清白蛋白A. 1.6 底物缓冲液一乙醇胶水叠氮化纳CNaN3) 用盐酸调至pH9.8，加水至1LA.2 实验步骤97 mL 600 mL 0.2 g A. 2.1 按要求的浓度1)用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加200L。A.2.2 将酶联板放在37C孵宵2h4 h。A. 2. 3 用PBST加满各孔，然后倒掉，孔向下在滤纸上拍干，再重复两次。A.2.4 每孔加入200L含2%脱脂奶粉的PBST封闭梅联板，放在370C孵育30min。A.2.5 去除封闭缓冲液并拍干。A. 2. 6 同步骤A.2.
9、 3洗板。1)不同批次的抗体浓度、阴性对照和阳性对照浓度是不一样的，稀释倍数要根据当时批次而定。如果是检测试剂盒.则根据试剂盒的要求商定。3 SN/T 1616-2005 A.2.7 取1g待检测组织研碎，加入2mL10 mL的抽提缓冲液，过滤得到待检样品液。A.2.8 分别将稀释到适当浓度的阳性对照、阴性对照和待检样品各200L加入已钮被的孔中.为保证实验的准确性，建议每个样品再设一个重复。A. 2. 9 4C下孵育过夜。A. 2.10 同步骤A.2. 3洗板。A. 2. 11 用稀释缓冲破将抗体(单克隆抗体)稀释到适当浓度，每孔加100LA. 2.12 在37C下孵育2h。A. 2.13
10、罔步骤A.2. 3洗板。A. 2.14 用结合缓冲液将标有碱性磷酸醋酶的兔抗鼠IgG稀释到适当浓度，每孔加200L。A. 2. 15 37C下孵育2h。A.2.16 同步骤A.2. 3洗板，以确定所有未结合的抗体都被洗掉。A. 2.17 按1mg/mL的浓度将对硝基苯磷酸铀溶于底物缓冲液中(使用前配并注意避光以防变色), 制成底物溶液。A. 2.18 锋孔加100L底物溶液。A. 2.19 室温下孵育30min60 min, A.2.20 在酶联仪405口m波长下检查各孔的吸收值OD405, A.3 结果判断当样品OD制/阴性对照OD二三2时，判定结果为阳性;如果是试剂盒，根据试剂盒的说明来判
11、定。4 SN/T 1616-2005 附录B(规范性附录)生物测定(鉴别寄主及其症状)B. 1 试材B. 1. 1 鉴别奇主:采用本氏烟(Nicotianabenthamiana)、克科夫兰烟(Nicotianaclevelandii)和曼陀罗(Datura stramonium)。先种于隔离温室(30C左右)大花盆中育苗，出商后移载至小盆中，长到3片4片叶时用于接种鉴定。B. 1.2 磷酸盐缓冲液(pH7.4)、硅藻土0B.2 方法B. 2.1 病样加1: 1的磷酸盐缓冲液，在研钵中研碎。B. 2. 2 叶面预先撒上少量硅藻土，将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面。B. 2. 3 自来水冲洗叶衰
12、。B. 2. 4 做好标签，置于隔离温室中。B. 2. 5 每天观察记载寄主反应。B.3 鉴别寄主的症状表现B. 3.1 本氏烟(Nicotianabenthamiana) :逐渐扩大的褪绿斑，然后是系统卷叶、畸形和泡斑。B.3.2 克利夫兰烟(Nicotiana clevelandii) :褪绿局部斑，然后表现为严重的畸形、不规则的黄脉带和泡斑。B.3.3 曼陀罗(Daturastramoni um ) :表现为周部的褪绿和坏死斑，然后发展为系统脉带、卷叶和畸形。5 SN/T 1616-2005 C. 1 试剂0.1 mol/L的磷酸缓冲掖CpH7.2): 磷酸氢工铀CNa2HP04) 磷酸
13、二氧销CNa丑2P04) 加水至1L。C.2 实验步骤C. 2. 1 Formvar膜制作附录C(资料性附录)免疫电镜观察68.4日lL31. 6 mL 将聚乙烯醇缩甲睦i容于二氧甲烧，配成0.2%0.3%溶液，贮于冰箱内备用。制膜时取一块干净的玻璃片插入搭液中，取出倾斜待撞撞挥发，用镶尖或刀片沿玻璃边划菇，再将玻璃片以一定角度缓慢插入蒸馆水中，使薄膜从政片上脱蔼下来漂浮于水面，将干净的铜网小心摆上，再用一块滤纸覆盖其上.捞起后置于培养血中干燥备用。C. 2. 2 抗血清包被锢网C. 2. 2.1 将一滴(约10L)适当政度的抗血清置于石蜡板上.用表面覆盖有Formvar膜的铜网覆盖其上，37
14、C下1h。C.2.2.2 用0.1moVL的磷酸缓冲液(pH7.2)洗网2次3次.睬干。C.2.3 电镜样品制备C. 2. 3.1 将一滴病汁液置于石蜡板上，用钮被有抗血清的铜网在病汁液上吸附30min45 min, 4C下。C. 2. 3. 2 用2%methylaminetungstateCpH5. 0)5滴7滴洗网。C.2.3.3 用2%乙酸双氧铀负染1min，琼干即可用于电镜观察。6 OONl户FHZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准非洲木薯花叶病毒检测方法SN/丁16162005主+中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷是印张o.75 字数11千字2005年11月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年11月第一版+ 定价8.00元如有EP装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 2-16462 SN/T 1616一2005
