1、GB 18133-2000 前当口随着我国经济、国际贸易和技术合作的发展，需要尽快提高我国马铃薯种薯的质量，并使之能与国际标准接轨，有必要制定我国的马铃薯脱毒种薯质量标准。本标准中附录A、附录B、附录C、附录D和附录E都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口.本标准起草单位g黑龙江省农业科学院马铃薯研究所、农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨、黑龙江省农业科学院生物技术研究中心.本标准主要起草人z崔荣昌、李芝芳、吴国林、王乐凯、雷勃钧、赫世涛。331 中华人民共和国国家标准马铃薯脱毒种薯GB 18133- 2000 Certified seed potatoes 1 范回
2、本标准规定了马铃薯脱毒苗和各级马铃薯脱毒种薯的质量指标及检验方法。本标准适用于马铃薯脱毒苗及脱毒种薯生产、销售过程中的质量鉴定.2 定义本标准使用下列定义。2. 1 脱毒苗应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒CPVY)、马铃薯S病毒CPVS)、马铃薯卷叶病毒CPLRV)等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒CPSTVd).才确认是脱毒苗。2.2 脱毒种薯从繁殖脱毒苗开始，经逐代繁殖增加种薯数量的种薯生产体系生产出来的。脱毒种薯分为基础种薯和合格种薯两类。基础种薯是指用于生产合格种薯的原原种和原种g合格种薯是指用于生产商品薯的种薯。2. 2. 1 基础种
3、薯2分为三级。2.2.1.1 原原种pre-elite 用脱毒苗在容器内生产的微形薯CMicrotuber)和在防虫网、温室条件下生产的符合质量标准的种薯或小薯CMinituber), 2.2.1.2 一级原种el出I用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。2.2.1.3 二级原种elite 1 -级原种作种薯，在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯.2.2.2 合格种薯z分为二级。2.2.2.1 一级种薯certfied grade 1 用二级原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。2.2.2.2 二级种薯certified grade I 用一级种薯作种
4、薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯。2.3病毒病株允许率脱毒种薯繁殖田中病毒病株的允许比率。2.4 细菌病株允许率脱毒种薯繁殖田中细菌病株的允许比率.2.5 混杂植株允许率脱毒种薯繁殖田中混杂的其他马铃薯品种植糠的比率。国家质量技术监督局2000-06-13批准到10-01实施332 GB 18133一20002.6 有缺陷薯畸形、次生、龟裂、虫害、冻伤、黑心和机械损伤的薯块。3 控制和汝除的病害3. 1 控制的病害3. 1. 1 马铃薯病毒病z脱毒种薯繁殖田中，具有花叶、卷叶、条斑坏死等病毒病症状的植株。3. 1.2 马铃薯黑腔病Erwiniavar. atroseptica (Va
5、n Hall) Dye. 或Erwiniavar. carotovora (ones Dye. )。3.1.3 马铃薯青枯病(Pseudomonussolanacearum E. F. Smith) 0 3.2 汰除的病害3. 2. 1 马铃薯纺锤块茎类病毒(PotaoSpindle Tuber Viroid. PSTVd). 3. 2. 2 马铃薯环腐病CorynebacteriumSepedonicum (Sieck &. Kott. ) Skapt &. BurkhJ 0 3. 2. 3 马铃薯癌肿病Synchytriumendobaiticum (Schilb. ) Perc. 。4
6、质量要求4. 1 各级别脱毒种薯固的植株带病指标应符合表1要求。表1各级别种薯带病植株的允许率第一次检验第二次检验第三次检验病害及混杂株.%病害及混杂株.%病害及混杂株，%类病环腐病毒黑腔混杂类病环腐病毒黑腔混杂类病环腐病毒黑腔种薯级别毒植病植病植病和植株毒撞病植病植病和植株毒植病植病植病和株株株青桔株株株青枯株株株青枯病植病植病植株株株原原种。级原种。25 O.5 O.叫。O.l 。运O.1 级原种。. 25 三三O.5 。1 f; 0. 25 。0.1 一级种事。0.5 1.0 O.5 。卡0.250.5 运O.1 二级种薯。2. 0 3. 0 1. 0 。1 012.0 :S; Q. 1
7、 4.2 一、二级种薯的块茎质量指标应符合表2要求。表2种薯的块茎质量指标块茎病害和缺陷允许率，%环腐病。湿腐病和腐烂0.1 干腐病:S;1. 0 疮癫病、黑痞病和晚疫病z轻微症状(1%-5%块茎表面有病斑lO. 0 中等症状(5%10%块茎表面有病斑):5.0 有缺陷薯冻伤除外O.l 冻伤:S; 4. 0 混杂植株。333 GB 18133-2000 5 检验方法5. 1 脱毒茵的检验5. 1. 1 脱毒后的检验某一品种获得一批组培再生苗后，要逐株鉴定带病毒和类病毒状况，检测筛选的无马铃薯X，S、Y病毒，马铃薯卷叶病毒(PLRV)和类病毒的组培苗才能确认是脱毒茵.检测方法应符合附录A和附录B
8、的要求。5. 1. 2 扩繁前的检验扩大繁殖前，对脱毒苗要再次检测，确认元马铃薯X，S、Y病毒、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和类病毒后，方可用于扩大繁殖。检测方法应符合附录A和附录B的要求。5. 2 脱毒种薯的检验5.2. 1 在种植脱毒种薯的田间进行目测植株质量检验.检测方法应符合附录C的要求。如需进步确认时，用附录D中所列的方法检验。5.2.2 检验数量对田间生长的植株作整体观察后，按表S方法随机抽样检验并记录于表4中。表3不同面积田块的检验点数和植株数面积.hm2检验点数和每点检验植株数运Q.1 随机抽样检验2点，每点100株0. 1l-1 随机抽样检验5点.每点100株1.1-5 随机抽
9、样检验10点，每点100株;5 随机抽样检验10点，每点100株，超出5h旷的面积.划出另一检验区，按本标准规定的不同面积的检验点，株数执行表4检验记录马铃薯脱毒种薯田间检验记录单繁种单位z种薯级jlJ, 面积2晶种:检验日期2年月日项目植株每点混杂各类病株数物候株数株数检验员备注花叶卷叶条斑坏黑眨青枯签字)点别期病株病株死病株病株病株其他1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 且计% 5.2.3 原原种和原种的检验334 G 18133-2000 生育期间要进行三次检验。第一次检验是在植株现蕾期，第二次在盛花期，第三次在枯黄期前二周。由繁种单位检验，做好检验记录并报检验部门备案，需复查时，
10、由检验部门派员复核检验。5.2.4 一级种薯和二级种薯的检验生育期间进行两次田间检验.检验时间与原原种和原种的第一、二次检验时间相同。5.3 种薯的块茎质量检验于销售时，随机抽取种薯总量1%的块茎样品进行块茎质量检验。5.4 种薯混杂块茎允许率检验于销售时，按照块茎的薯形，薯皮颜色，薯肉颜色，芽眼深浅等待征进行种薯混杂块茎允许率检验e如需进一步确认，按附录E马铃薯水溶性蛋白聚丙烯酷胶凝胶电泳法检验种薯混杂块茎比率。6 自j定规则6. 1 脱毒种薯分级以脱毒种薯繁殖回所播种的种薯级别、带病植株比率和混杂植株比率为定级标准。6.2 各级别脱毒种薯带病毒病株比率，带黑腔病和青枯病株比率以及混杂植株比
11、率三项质量指标，任何一项不符合原来级别质量标准但又高于下一级别质量标准者，判定结果均按降低一级定级别.6. 3 经检验定级合格，签发马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书(见表5)0表5马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书年月日编号z种薯生产单位z种薯级Ij, 品种z重量B上述种薯经按中华人民共和国国家标准(GB181332000马铃薯脱毒种薯价检验合格特发此证.检验人t检验机关.7 包装、标签7.1 包装7. 1. 1 用清洁的麻袋包装。(签字(印章7.1.2 每一麻袋装人脱毒种薯80险。7.2 马铃薯脱毒种薯标签kg 7. 2. 1 标签用材要求用较柔软、厚度o.10-0.
12、 12 mm的白色聚乙烯薄膜制造.应符合图l规格要求。7.2.2 标签正面的项目用黑色5号宋体字印刷，标签反面为空白。在标签正面项目栏中。用黑色记号笔或蓝色圆珠笔填写记载的事项。7.2.3 麻袋内放人枚标签，在麻袋外上部拴上枚标签。335 正面EH H 8 运输GB 18133-2000 4cm 。d 马骨薯脱毒种事时级jlJ I H 晶种m E u 畸合格证书J自且编号F叫生产单位地址N 6cm 图1马铃薯脱毒种薯包装袋上拴挂的标签8. 1 不同品种、不同级别的种薯在一起运输时严防混杂。8.2 防止机械碰伤，防雨、防热、防冻。336 。青面GB 18133-20 附亵A标准的附录酶联免瘦眼附
13、试瞌法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 应用双抗体夹心法(DoubleAntibody Sandwich Method)检测马铃薯脱毒苗是否带有马铃薯X、Y、S病毒和马铃薯卷叶病毒(PLRV)等主要马铃薯病毒。A1 仪器和设备A 1.1 聚乙烯微量满定板:有40孔和96孔两种规格，均可使用.A 1.2 被量可调进样器s需要2-10L、10-50L和10-200L三种规格，并附有相应规格的塑料头。A 1.3 冰箱。A 1. 4 保温箱z温度定为3TC。A 1.5 玻璃或自瓷制造的小研钵。A 1.6酶联免疫检测仪2检测辣根过氧化物酶(HorseradishPe
14、roxidase. HRP. )标记的酶标记抗体用490 nm波长检测，碱性磷酸(Alk.linephosphatase. AKP)标记的酶标抗体用405nm波长检测。A2 应用的试剂为分析纯级规格，用水为蒸馆水。A2.1 抗体免疫球蛋白(r-globulin)和酶标记抗体(Co叩19ate)从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1mg/mL.作为包被微量滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体，一般使用浓度常在1 1000以上。贮藏于4C条件下备用。A2.2 碳酸盐包被缓冲液，pH9.6 ,1. 59 g碳酸销(NaCO，).2.93 g碳酸氢销(N
15、aHCO，)加水到1Lo A2. 3 PBS-Tween-20缓冲液.pH7. 4 , 8 g氯化销(NaCl), O. 2 g磷酸二氢惆(KH，PO.)，2. 2 g磷酸氢二锅(Na，HPO，0 7H,O) (或2.9g Na,HPO. 12H,O) .0.2 g(氯化饵)KC1，:bn水到1L，然后加0.5mL Tween-20。洗涤微量滴定板用。A2.4 样品缓冲液2取PBS-Tween-20缓冲液100mL，加聚乙烯毗咯烧酣(PVP)2go A2.5 底物缓冲液g取O.2 mol/L N.,HPO, 12H，O溶液25.7mL加0.1mol/L拧橡酸溶液24.3mL，加水50mL ,p
16、H5. O(现用现配)0 I临用前加磷苯二胶40mg，30%过氧化氯(H，O，)O.15 mL，混匀，避光放置。应为白色或微黄色溶液。A2.6 终止液z为0.2mol/L硫酸溶液。用1体积浓硫酸加9份水.A3 操作步骤A3.1 包被徽量滴定板s把免疫球蛋白用包被缓冲液按1I 1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加人稀释的免疫球蛋白200L。在3TC条件孵育1h，或在4C条件下过夜.A3. 2 洗涤包被的微量滴定板甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在一叠吸水纸上敲打徽量滴定板，以除尽残留的溶液.向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留3min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3次，以
17、除尽未被吸附的免疫球蛋白。A 3. 3 加被检测的样品A3. 3. 1 取样z在无菌条件下，从试管茵上剪下长2cm茎段，放在小研钵内，把取样的试管苗放回到试管中，封好管口。把样品编好号，以便按检测结果决定取舍。337 GB 18133-2000 A 3. 3. 2 向小研钵中加样品缓冲液，加入的液量依每个样品上样的孔数而定。例如每个样品准备上样一个样品孔时，可加入0.4mL样品缓冲液，研磨后可得200L清液，够上一个样品孔用。A3. 3. 3 加检测样品g向编好号、洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加入提取的样品液200L，每一块微量滴定板上，可设置两个阳性对照孔，两个阴性对照孔和
18、两个空白对照孔。A3. 3. 4 把加凳样品的微量滴定板，在37C条件孵育4-6h.或在4C条件下过夜，然后按A3.2洗涤微量滴定板。A3. 3. 5 加酶标记抗体z把酶标记抗体用样品缓冲液按1 1000稀释，向每个样品孔中加入200L稀释的酶标记抗体。A3. 3. 6 洗涤微量滴定板2按A3.2洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。A3. 3. 7 加底物:向每一样品孔内加底物缓冲液100L。这是因为使用国产酶标检测仪测定光密度时，如底物量多，常污染检测镜头，使测得的光密度值不准确;如应用Bio-Rad550型等进口酶标检测仪时则可加入200L底物。当观察到阳性对照孔与阴性对照孔显现的颜
19、色可以明确区分时(辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现桔红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色h或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色可以明确区分时，每孔加入30L终止液，如加入200L底物缓冲液时则加入50L终止液(碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液)。A4 结果判定A4.1 目测观察显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比。显现白色表明为阴性反应，记录为:显现淡桔红色即为阳性反应，记录为十g依色泽的逐渐加深记录为十+和+。A4.2 用酶联检测仪测定光密度值:样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍，即判定为阳性反应(阴性对照孔的光密度值应;0.1)。附最B(标准的附录)往复双向
20、骤丙烯.股凝胶电泳法(Two-dimensionaJ poJyacryJamide GeJ EJectrophoresis) 应用本法检测脱毒苗是否感染有马铃薯纺锤块茎类病毒。时仪掘和设备B1.1 电泳仪。B1.2 电泳槽。B1.3 转数为3000 r/min以上的离心机。B1. 4 冰箱。B1.5 高温水浴。B1.6 微量可调进样器，需要2-10L.I0-50L.I0-200L三种规格，并附有相应规格的塑料头。B1. 7 玻璃或白瓷制造的小研钵。B1.8 带乳头的玻璃小吸管。B1.9 小塑料盘。B1.10 牙签、滤纸等。B2 试剂为分析纯级规格，用水为蒸馆水338 G8 18133-2000
21、 82.1 核酸提取缓冲液，0.53mol/L氨水(N凡H), 0.013 mol/L乙二胶四乙酸纳(Na，.EDTA)，用三经甲基氨基甲烧(Tris)调为pH7.OJ , 4 moI!L氯化铿(LiC)。82.2 10X电极缓冲液，0.89 mol/L Tris , O. 89 mol/L棚酸，2.5mmol/L Na,.EDTA,pH8. 3. 82.3 载样缓冲液，60mL1X电极缓冲液加40mL丙三醇，含0.25%二甲苯蓝，0.25%澳盼蓝。82.4 水饱和盼g约为80%酸的水溶液，内含0.1%经基噎琳。82.5 30%丙烯酸胶贮液s丙烯瞰胶30g，亚甲基双丙烯酷胶0.75g，用水定容
22、为100mL，过滤，贮于4C条件下。82.6 10%过硫酸镀溶液，0.1g过硫酸镀加水1mL(现用现配。82.7 四甲基乙二胶(TEMED)。82.8 4 moI/L乙酸销溶液，5.44 g元水乙酸铺定容为10mL. 82.9 服:按8moI/L用量加到反向电泳凝胶中，即所谓的变性胶。82.10 核酸固定液z含10%乙醇，0.5%醋酸的水溶液。82.11 0.2%硝酸银溶液。82.12 核酸显影液，0.375mol/L氢氧化销(NaH)，2. 3 mmol/L跚氢化销(NaBH，)，O. 4%甲醒(37%，W/V)。82.13 增色液，70mmollL碳酸锅(Na2C，)水溶液.83 核踵提取
23、83.1 在无菌条件下，从试管苗上剪下长2cm茎段，放于小研钵中.把取样的试管苗放回试管中，封好管口，编号，以便根据检测结果决定取舍。8 3- 2 向小研钵中加人0.4mL核酸提取缓冲液，0.6mL水饱和酶，研碎，倒入小塑料离心管中。83.3 3000 r/min(可在3000-8 000 r /min幅度内离心，一般离心速度高些好)离心15min.用带乳头小吸管口把上层水相吸到另一清洁的离心管中。83.4 向小离心管中加入1mL乙蹲，1滴4mol/L乙酸锅，混匀后放在冰箱冰盆中至少冷冻30min. 83. 5 3 000 r /min离心15min，倒掉乙醇，用少量乙醇轻轻冲洗管壁两次，倒放
24、离心管，控干剩余的乙醇。83.6 向每一离心管中加入50L载样缓冲液，用干净牙签混匀，即可用于上样电泳.84 电泳84.1 正向电泳z用5%聚丙烯殷殷凝胶，用lX电极缓冲液，进行从负极到正极电泳(上电泳槽的电极是负极，下电泳槽是正极)，电流量为每厘米宽凝胶5mA。上样量为6L.当二甲苯蓝示踪染料迁移到凝胶板中部时从上祥原点迁移约6cm)，折开菠璃板，横切下约1cm 宽的带有二甲苯蓝带的凝胶条，平移到玻璃板的底部边缘，安装好玻璃板，灌进含8mol/L腺的变性胶a把玻璃板装回到电泳槽内，变换电极，进行从正极到负极的反向电泳.约20min，当二甲苯蓝带已经完全进入变性胶中以后，停止电泳。拆开电泳槽，
25、取下玻璃板。84.2 加温带变性胶的电泳玻璃板，促使类病毒变性.在80C水播中，加温电泳玻璃板30min，然后把电泳玻璃板装回到电泳槽中.84.3 反向电泳=是从正极到负极的电泳。电极缓冲液与电流量和正向电泳相同.电泳约2h，当二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶板上方距电泳原点约4cm处，停止电泳，取出凝胶片进行银染色.85 银染色85.1 核酸固定2把凝胶片放在盛有200mL核酸固定液的塑料盘中，轻轻振荡10min，然后倒掉固定液。339 GB 18133-2000 B5.2 向塑料盘中加进200mLO. 2%硝酸银溶液，轻轻振荡15min，然后倒出银溶液(可重复使用)。B5.3 用蒸馆水冲洗凝胶板
26、，以除掉残留的银溶液，共冲洗四次，每次用水200mL.每次冲洗15s。B5.4 核酸带显色g加入核酸显影液200mL(现用现配).轻轻振荡，直到核酸带显现清楚为止，然后用自来水冲洗停显。B5.5 增色，110入增色液200mLB5.6 结果判定=在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带(即最下方的核酸带);其上为寄主核酸带，在寄主核酸带与类病毒核酸带之间有空隙，二者可明显区分开。附录C(标准的附录)马铃薯主要病毒病、细菌病和真菌病症状目测撞到襄按表C1描述的马铃薯植株症状和块茎症状，目测检验马铃薯类病毒，病毒和细菌性病害。表C1病害名称植株症状块茎症状马铃薯纺锤病株叶片与主茎间角度小，呈锐
27、角，叶片上感病块茎变长.呈纺锤形，眼芽增多，穿眉凸块茎类病毒坚，上部叶片变小，有时植株矮化起，有时块茎产生龟裂叶片卷曲，呈匙状或筒状，质地脆，小叶常有块茎变小，有的品种块茎切面上产生褐色网马铃薯卷叶病脉间失绿症状，有的品种顶部叶片边缘呈紫状坏死或黄色，有时檀株矮化叶片有黄绿相同的斑驳或褪绿，有时叶肉凸块茎变小马铃薯花叶病起产生皱缩.有时叶背叶脉产生黑褐色条斑坏死.生育后期叶片干枯下垂.不脱落一丛植株的一或一个以上主茎的叶片失水感病块茎维管束软化，呈波黄色，挤压时组萎麓，叶色灰绿并产生脉间失绿症状.不久织崩溃呈颗糙状，并有乳黄色菌隙排出，表马铃薯环腐病叶缘于枯变为褐色，最后黄化枯死.枯叶不皮维管
28、束部分与薯肉分离，薯皮有红褐色网脱落纹病株矮小，叶片褪绿，叶缘上卷、质地硬，复感病块茎脐部黄色，凹陷，扩展到髓部形成马铃薯黑腔病叶与主茎角度开张，茎基部黑褐色，易从土黑色孔洞，严重时块茎内部腐烂中拔出病株叶片灰辈革色，急剧萎藩，维管束褐色，以感病块茎维管束褐色，切开后乳白菌液外马铃薯青枯病后病部外皮褐色，茎断面乳白色，粘稠菌液溢，严重时，维管束邻近组织腐烂，常由块茎外溢芽眼流出菌在一般植株生长正常，有时在与土壤接触的茎本病发生于植糠的地下部位，但根部不受侵基部处长出绿色肉质瘤状物，以后变为褐害。在地下茎、茎上幼芽、匍匍枝和块茎上均色，最后脱落可形成癌肿.典型的癌肿是粗糙柔嫩肉质的马铃薯癌肿病球
29、状体，并可;成一大团细胞增生组织.其色泽与块茎和匍匍枝相似.如露出地面则带有绿色，老化时为黑色.块茎上的症状很象花椰莱340 GB 18133 -2000 附录D标准的附录)马铃薯环腐病鉴定法用格兰氏染色和茄子接种鉴定法结合起来鉴定马铃薯脱毒苗和脱毒种薯是否感染马铃薯环腐病。当用格兰氏染色鉴定为阳性结果时，再用茄子接种鉴定法进行鉴定，也产生阳性结果时，才能确认是马铃薯环腐病菌。01 格兰氏染色CGramStain) 01.1 试验设备01. 1. 1 显微镜。01. 1. 2 载玻片。01. 1. 3 酒精灯。01.2 试剂所用试弗l为分析纯级，用水为蒸馈水，个另IJ为无菌水。0 1. 2.
30、1 龙胆紫染色液，2.5g龙胆紫加水1IJ1 L , 01.2.2 碳酸氢纳溶液，12.5 g碳酸氢锅CNaHCO，)加水到1L , 01. 2. 3 硕媒染液，2g模溶解于10mL 1 mol/L氢氧化铺CNaOH)溶液中，加水定溶为100mL。01. 2. 4 脱色剂，75mL95%乙醇加25mL丙酬。01. 2. 5 碱性品红复染液:取100mL碱性品红95%乙醇饱和液，加水到1L。0 1. 3 取制制备涂片所有试验用具都要用70%酒精擦拭灭菌。01. 3- 1 鉴定植株2从地表上方2cm处割断，用银子从切口挤出汁液，滴1漓于载玻片上，风干后，用酒精灯火焰烘烤23次固定。另一方法是，从切
31、口一端切下0.5cm厚茎片，在小研钵中研磨，吸取1滴汁液滴子载玻片上，风干，用火焰烤23次固定。01. 3. 2 鉴定块茎z切开块茎，如维管束处有菌版或渗出物，用慑子压挤，滴1滴于载玻片上，加1滴元菌水稀释，风干后，用火焰烘烤23次固定。如无渗出物，用镀子从维管束附近取出一些碎组织放在载玻片上，加一滴无菌水，移摔碎组织。风干后，用火焰烘烤23次固定。01.4 涂片染色01.4.1 满1漓龙姐紫与碳酸氢销等量混合液现用现配于涂片上，染色20.，0 1. 4. 2 滴1滴腆媒染液媒染20s.滴水洗涤。01.4. 3 滴1滴乙醇，丙嗣脱色液，脱色510s.滴水洗涤。01. 4. 4 滴1滴碱性品红溶
32、液复染2-35，滴水洗涤.风子。01.5 镜检和结果判定用10001 500倍显微镜镜检，如见到呈蓝紫色的单个细菌或集聚为二、三或四个细菌，即为环腐病细菌，判定为阳性反应，染成粉红的不是环腐细菌，如j定为阴性反应。02 茄子接种鉴定法02.1 寄主植物准备一般常用黑美丽(Blacklkauty)品种。先在大花盒中育苗，出苗后移植到装有营养土的花盒内，每盆l株。当茄子长J1J23周出现第三片真叶时即可用于接种鉴定。341 GB 18133-2000 02.2 接种体制备按01.3.1与01.3. 2方法制备接种体.110适量元菌水稀释。02.3 接种方法用1mL卡介苗注射器吸入市!备好的接种体，
33、用4号针头，在茄苗真叶与子叶之间的茎部作针刺接种，每株茄苗针刺三个部位。接过种的茄苗放在2025C的温室中，保持相对湿度70%以上，每日光照为12ho 02.4 症状表现及结果判定接种后1周，第1片真叶叶缘出现水渍状症状.12天后症状发展为叶缘或叶脉间失水萎藩，褪绿.22天后发病部位坏死，叶片长成畸形。茄子接种后产生上述症状的，说明接种体中带有马铃薯环腐细菌，制备接种体的样品为阳性反应5元症状的为阴性反应，证明接种体中不带环腐细菌。附录E(标准的附录)马铃薯块茎水溶性蛋白骤丙烯.肢凝胶电泳鉴定法应用马铃薯块茎水溶性蛋白的电泳谱带来鉴定块茎的品种纯度.E1 仪揭和设备E1.1 电泳仪。E1.2
34、电泳槽。E1.3 转数为3000r/min以上的离心机。E1.4 冰箱。E1. 5 微量可调进样器，需要210L.1050L两种规格，并附有相应规格的塑料头。E1.6 玻璃或自瓷制造的小研钵。E1.7 带乳头的玻璃小吸管。E1. 8 小塑料盘。E2试剂为分析纯级规格.用水为蒸馆水。E2.1 亚硫酸锅溶液dg亚硫酸销(Na，S03)加0.75g焦亚硫酸销(Na，S，05)加20mL水。E2.2 载样缓冲液25mg澳酣蓝加50mL水，低速离心后留上清液，再加25g m;糖。E2.3 30%丙烯酿胶贮液g丙烯瞰胶30g.甲基双丙烯眈胶1.5 g.用水定容为100mL.过滤，贮于4C条件下。E2.4
35、10%过硫酸镀溶液，0.1 g过硫酸镀加1mL水，现用现配E2.5 四甲基乙二胶(TEMEDl。E2.6 8X电极缓冲液贮液，1mol/L兰经甲基氨基甲烧(Tris).0.15 mo/L棚酸.pH8.90使用时.1份贮液加7份水，即为0.125mo/L Tris .0.02 mol/L翻酸.pH8.9的电极缓冲液。E2.7 0.025%考马斯亮疏R250染色液z配制方法是，160mL水.40mL甲醇.14mL冰醋酸，再加12 g三氯乙酸，然后加5mL1%考马斯亮蓝R-250元水乙醇溶液，混匀。E2.8 脱色液z按140mL水.60mL甲醇10mL冰醋酸的比例配制。E3 块茎水溶性蛋白提取E3.
36、1 取新鲜或贮藏的块茎，用打孔器取样，去掉表皮，称取5g薯肉放于小研钵中，加0.5mL亚硫酸342 GB 18133-2000 纳溶液，在18C冷冻过夜。E3.2 在室温条件下融化冷冻的样品，研碎，3000 r/min离心10min。E3. 3 取上清液。.8mL加0.2mL载样缓冲液，混匀，即制备成供鉴定用的样品。E4 电泳E4.1 用6%聚丙烯醺胶凝胶，每毫升凝胶中含Na，SO，O. 33 mg.应用1X电级缓冲液cap1份电极缓冲液贮液加7份水)进行从负极到正极电泳(上电泳槽的电极是负极，下电泳槽是正极)，电流量为每厘米宽胶板5mA.上梓量为10-20L.E4.2 如室温较高，可把电泳槽放于冰箱保鲜室中电泳.E4.3 当示踪染料澳盼蓝达到凝胶底部边缘时停止电泳，取出凝胶片进行染色.E5 梅色E5.1 用。.025%考马斯亮蓝R-250染色3h，然后用脱色液脱色，整个脱色过程换脱色液三、四次。E5.2 由于用考马斯亮蓝染色需要较长的时间s若急于观察结果时，可参照附录B的B5项银染色法可迅速完成胶板染色。E6 结果判定在每批鉴定中，加入已知的品种作对照，参照已知品种的电泳谱带确定鉴定结果.1I3
